组DNA技术(.docVIP

★复习：回忆以下概念 克隆、重组DNA技术、限制性核酸内切酶、回文结构、目的基因、克隆载体??、质粒、噬菌体 ★新授： 一、重组DNA基本原理 述：一个完整的DNA克隆过程包括：目的基因的获取，基因 载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA 分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体 细胞，就可以获得大量该基因编码的相应产物。 （课本P117，图9－10） 目的基因的获取 述：利用重组DNA技术构建嵌合DNA时，欲插入载体DNA 的外源DNA片段中即含有我们感兴趣的基因或DNA序列 ――目的基因。目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源： 化学合成法 述：如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的 氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列后，再 利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用 该法合成的基因有人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、 脑啡肽及干扰素基因等。 ?2．细胞提取（基因组DNA） 步骤：提取基因组DNA(限制性核酸内切酶切(DNA片段（含感性趣的基因） (片段分别与克隆载体重组(分别转入不同受体菌扩增（存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库，G文库）(筛选含感兴趣基因的菌落(扩增回收感性趣的基因。 3．cDNA文库（幻灯59、60） 述：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的 DNA (cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连 接后转入受菌体，扩增为cDNA文库，然后再采用适当方 法从cDNA文库种筛选出目的cDNA。与基因组DNA文库 类似，由总mRNA制作的cDNA文库包括了细胞全部 mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前 发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。 步骤：提取mRNA ( 逆转录合成cDNA ( 与载体重组， 转入菌体 ( cDNA文库 ( 筛选含感性趣基因的菌落 (扩增回收感性趣的基因。 4．DNA扩增 述：如知道了目的基因5’与3’端的核苷酸序列，可设计合适 的引物，在具备其他相关条件下，采用聚合酶链反应扩增 特异性目的基因。 克隆载体的选择与改建 述：外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源 DNA连接到复制子上，外源DNA则可做为复制子的一 部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。 重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一项极富技 术性的专门工作，根据不同的目的、操作基因的性质， 选择和构建相应的载体。一般常用破碎细菌、密度 梯度离心等方法来取得纯化的载体DNA。 良好的克隆载体应具备的条件：①②③④⑤（课本P118） 目的基因与载体的连接 述：通过不同途径获取含目的基因的外源DNA、选择或改建适当的克隆载体后，下一步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA连接酶将外源DNA与载体共价连接的。但在连接前，首先需要对目的基因和载体进行分离、剪切，为构建重组DNA分子作准备，这些过程涉及到一系列酶的催化反应，酶是重组DNA技术必不可少的工具。 选择合适的限制酶从DNA链上切割所需的目的基因，使分离所得的基因具有黏性末端 2．使用同种限制酶切割质粒DNA，使其切口具有与目的基因相同互补的黏性末端 3．在一定条件下，将目的基因与载体用DNA连接酶连接起来，构成DNA重组体。 （四）重组DNA导入受体菌 1．外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子后，需将其导入受体菌。随着受体菌的生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖 2．筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆 3．选择适当的受体菌（安全――在人肠道无存活或存活率极低，应为限制酶和重组酶缺陷型。如E.coli K12的改造菌），然后经特殊方法处理，使之成感受态细胞，即具备接受外源DNA的能力。 4．根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA 分子有转化、转染和感染等不同手段。 （五）重组体的筛选 ?述：通过转化、转染或感染，重组体DNA分子被导入受体细胞， 经适当涂布的培养板培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。由于每一重组体只携带某一段外源基因，而转化或转染时 每一受体菌又只能接受一个重组体分子，如何将众多的转 化菌落或转染噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑 所含重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程称筛选 或选择。 述：根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达 情况不同，可采取直接选择法或非直接选择法。?? 直接选择法――针对载体携带有某种或某些标志基因和目的 基因而设计的筛选方法。 ⑴抗药性标志选择：抗药性标志基因如ampr、terr、kanr等。 转化后含抗药性标志基因的