鸡肌抑素基因的原核表达及蛋白纯化.pdfVIP

Heilongjiang Animal Science 18 and Veterinary Medicine No 7 2008 鸡肌抑素基因的原核表达及蛋白纯化 蓝赐华 ， ，刘为民 ，梁梓森 (1．佛山科学技术学院动物医学系，广东南海528231；2．华南农业大学兽医学院，广东广州510642； 3．广东温氏食品集团有限公司，广东新兴527400) 中图分类号：$831 文献标识码：A 文章编号：1004—7034(2008)07—0018—03 关键词：南海黄鸡；肌抑素基因；原核表达；蛋白纯化 摘 要：利用实验室保存的重组质粒pMD18一MSTN重新构建原核表达质粒pET一32a—MSTN，将其 转化到宿主菌大肠杆菌BI21上并进行诱导表达，再将所表达的融合蛋白进行纯化。结果表明：该基 因在宿主菌中成功表达；目的蛋白被成功纯化，且纯度较高。 肌抑素(Myostatin，MSTN)又称为生长分化因子 术服务有限公司；羊抗兔IgG(二抗)，广州鼎国公司 一 8(Growth differentiation factor，GDF一8)，属于转化 产品；TALON Single Step columns试剂盒(5 mL)，宝 生长因子～p(Transforming growth factor—p，TGF— 日医生物技术(北京)有限公司产品。根据发表在 p)超家族成员之～，由美国学者Mcpherron A C等 GenBank中鸡肌抑素全基因序列(AF346599．2)，利 人 在1997年首次发现。作为一个重要的肌细胞生 用软件Primer5．0设计1对引物：P 5 ～CGGGATC— 长调控因子，MSTN的主要功能是负向调控肌细胞的 CAGTAGTCAGCCCACAGAGAACG 一 3 ；P2 5 一 生长与分化l2』。由于MSTN基因突变或基因敲除并 CCGTCGACTCATCAGCACCCGCAACGAT一3 。弓l物 未导致动物致命的缺陷，但却极显著地促进骨骼肌的 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 增加。人们公认，该基因是通过基因改造进行品种改 大肠杆菌BI21、重组质粒pMD18一MSTN和质 良的最佳候选基因之一。随着对MSTN基因的生物 粒pET一32a，佛山科学技术学院基础动物医学实验 学功能研究的不断深入和应用推广，人们设想可以通 室保存；兔抗一MSTN高免血清(一抗)，吉林大学欧 过免疫学、内分泌学、选种等多种途径来促进畜禽的 阳红生教授惠赠。 生长，提高瘦肉率，提高饲料报酬。笔者前期对该基 1，2 试验方法 因作了初步研究，运用RT—PCR技术已经成功扩增 1．2．1 重组质粒pET一32a—MSTN的构建 用1对 出鸡MSTN cDNA序列，测序并成功构建了重组质粒 内切酶BamH I和Sal I对重组质粒pMD18一MSTN pMD18一MSTN。试验进一步对重组质粒pMD18一 进行双酶切，得到目的片段MSTN，用同一对内切酶 MSTN进行双酶切后得到目的片段MSTN，构建原核 对质粒pET一32a进行双酶切得到载体，利用T4 DNA 表达质粒pET一32a—MSTN，并在大肠杆菌中得到成 连接酶将载体和目的片段进行连接，转化大肠杆菌 功表达，为下一步研究该基因的生物学功能奠定了良 BI21受体菌。 好的基础。 1．2．2 阳性菌落的鉴定 将转化菌BI21进行菌液 1 材料与方法 PCR鉴定，PCR反应体系(25 L)如下：