探讨肺康饮含药血清对人肺癌细胞.docVIP

　　探讨肺康饮含药血清对人肺癌细胞 毕业 研究表明，目前许多抗药物的抗肿瘤作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的［4］。药物对肿瘤治疗的1个重要途径就是诱导肿瘤细胞凋亡，传统的益气法和活血法在肿瘤的免疫治疗中体现出较好疗效［5］。肺康饮就是我们根据扶正祛邪的治疗原则，在多年临床实践基础上，采用益气养阴、清热解毒法研制而成的。经临床观察应用，对于中晚期非小细胞肺癌患者有1定疗效，可降低化疗对患者免疫功能的影响，改善患者的生活质量［2］。 最近10年来，肺癌的发病率逐年上升，尽管治疗方法不断改进，但5年生存率不足14%［1］。肺癌严重危害着人类身体健康，其发病率高，病死率高，目前临床尚无理想的治疗方法。临床研究表明，中药组方在治疗肺癌方面取得了较好的疗效，中医药是肺癌综合治疗的重要手段之1。肺康饮是由竹叶、桑叶等数味中药组成的中药复方，经临床观察对肺癌患者有1定的疗效［2］，但作用机制还不清楚。为此，本研究采用中药血清药理学方法孵育人肺癌NC-H446细胞株，以细胞生长抑制率及凋亡率为观察指标，以期深入探讨肺康饮抗肺癌的作用机制。 1 材料与方法 1.1 人肺癌细胞系 人非小细胞肺癌NC-H446细胞株由中国医科大学细胞室提供，我院实验中心细胞室保存。 1.2 主要试剂 RPMI1640培养液、胎牛血清为GIBCO公司产品；噻唑蓝（MTT）及2甲基亚砜（DMSO）为BBI公司产品； Annexin V细胞凋亡试剂（北京宝赛公司）。 1.3 主要仪器 美国SHELLAB2300型CO2细胞培养箱；日本Nikon倒置相差显微镜；美国Sfat自动酶标分析仪；美国FACScan流式细胞仪等。 1.4 实验方法 1.4.1 肺康饮含药血清的制备 肺康饮由竹叶、桑叶等数味中药组成。传统方法煎制，浓缩为100%。按照文献方法［2］按成人用量定容为65mL/d计算，按成人65kg体重剂量的10倍灌胃，即每100g大鼠灌1mL药汁，对照组给予相同剂量生理盐水。给药3d，末次给药后1～2h无菌条件下自心脏取血，离心分离血清，56℃水浴，30min灭活，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。 1.4.2 分组与药物血清添加 分为正常血清对照组，肺康饮低剂量（5%）血清组、肺康饮中剂量（10%）血清组、肺康饮高剂量（15%）血清组。参照文献方法［2］制备药物血清温育液：①药物血清组：临用前将用药组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、15%。②对照组：对照组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度10%。 1.4.3 细胞培养 将NC-H446细胞株常规培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液（含青链霉素各100IU/mL）中，于37℃、5% CO2培养箱内连续培养。 1.4.4 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响 取对数生长期的NC-H446细胞株以1.50×106个/mL的细胞浓度接种于96孔培养板内，每孔体积200μL,在37℃、5% CO2培养箱内培养24h换液。采用直接加入法，分别加入不同浓度（5%、10% 、15%）的含药血清和对照血清。每组设4个复孔。继续培养24h、48h后，培养板每孔加入50μL MTT（2mg/mL），同样条件继续孵育4h，吸弃上清，每孔加入100μL2甲基哑砜（DMSO）振荡混匀，于酶标492nm测定各孔的吸光度OD值，计算相应的细胞抑制率： 抑制率（%）=（1- OD实验组/ OD对照组）×100% 1.4.5 肺康饮含药血清诱导肺癌细胞凋亡表达的测定 将传代的NC-H446细胞接种于100mL培养瓶中，以含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液置37℃、5%CO2孵育箱中培养；培养24h至对数生长期，弃培养液，分别加入含有不同浓度（5%、10%、15%）的含药血清及对照组血清的培养液各4mL，置培养箱中培养48h。收集48h含药血清培养的NC-H446细胞培养液，胰酶消化，PBS洗涤3次，置入10mL离心管中离心，4℃、1000rmp、10min，弃上清；加入70%乙醇4℃固定24h以上；上机前离心去除乙醇固定液，PBS清洗2次，加入100μL含钙PBS静置10min，加5μL Annexin V，10μL PI，避光反应15min，上机检测，以不含药血清处理的NC-H446细胞为阴性对照，计算相应阳性细胞表达率。 1.5 统计学方法 采用多因素方差分析法检测组间差异的显著性。所有统计学检验均应用SPSS11.5统计软件进行。 2 结果 2.1 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响 不同浓度的含药血清分别作用于NC-H446细胞株，分别于24h、48h采用MTT法检测各组血清对NC-H446细胞