MALDI-TOF快速准确分析蛋白质C-末端氨基酸序列.PDF

MALDI-TOF 快速准确分析蛋白质C-末端氨基酸序列 摘 要：本文使用LysC酶解蛋白样品，以TMPP-Ac-OSu对酶解产物进行衍生化修饰，并用DITC 树脂进行分离后，以岛津AXIMA Performance检测确定了蛋白C-末端氨基酸序列。 关键词：MALDI C-末端 LysC TMPP DITC 通过肽质量指纹图谱识别蛋白需要将蛋白酶解后，使用质谱来分析酶解产物，然后检索数 据库来确认得到的序列片段。然而，通过检索数据库来确定 N-和 C-末端序列却并不容易。原 因在于：1）处理和翻译后修饰经常导致蛋白质N-和 C-末端结构发生变化；2 ）离子抑制效应 的存在导致部分蛋白序列不可测定。 蛋白N-末端氨基酸序列可以使用蛋白测序仪（PPSQ-31A/33A ）或者蛋白N-末端测序组件 (ORFinder-NBTM)来检测。然而，对 C-末端结构来说，检测技术的需求使得蛋白末端氨基酸序 列分析变得比以往更为重要。这里以包含有特征C-末端蛋白的样品为例，介绍一种全新的、以 质谱分析氨基酸序列的成功例子。 1. 实验部分 1.1 仪器 岛津AXIMA Performance 1.2 实验步骤 1) 以赖氨酰肽链内切酶(LysC)消解目标蛋白，除了来自于蛋白C-末端的氨基酸，其余都被 转化为赖氨酸； 2) 酶解产物与琥珀酰亚胺基[三(2,4,6-三甲氧苯基)磷基]溴乙酸酯（TMPP-Ac-OSu ）反应， 氨基酸基团选择性的被TMPP-Ac基团修饰； 3) 反应后的产物加入到聚对苯二异硫氰酸酯树脂中（DITC树脂或玻璃），所有ε氨基基团 侧链为赖氨酸的肽均被DITC 树脂富集，不含自由氨基酸基团的蛋白C-末端多肽则不被富集； 4) 使用MS/MS检测分离出的蛋白C-末端肽链，只有包含有带强正电TMPP 的碎片离子可以 在质谱图上显示。通过比较不同碎片离子间质量数的不同，并通过基因序列来预测末端氨基酸 序列，可以确定蛋白C-末端氨基酸序列。 实验步骤具体流程如图1所示。 11 图1 质谱分析蛋白C-末端结构流程图 2. 结果与讨论 2.1 PfuRPA的MALDI质谱图 图2是包含有3种子单元的蛋白重组混合物PfuRPA （样品以LysC消解并以TMPP-Ac衍生修 饰后产物）的MALDI-MS谱图。RPA14，RPA32和RPA42这3种由酶解肽段衍生得来的子单元在 质谱图上均有显示，但是与C-末端肽段相连的RPA14和RPA32几乎没有显示。 2.2 DITC树脂分离后的C-末端肽段MALDI质谱图 图3显示的是每种C-末端肽段经过LysC酶解，TMPP-Ac修饰和DITC树脂处理后得到的质谱 图。所有源自内部序列肽段的衍生化反应产物均被DITC树脂富集，仅有源自于C-末端肽段可以 被检测到并显示在质谱图上。 2.3 C-末端肽段氨基酸序列 对源自C-末端的肽段进行二级质谱分析，通过比较不同碎片离子间质量数的不同，并通过 基因序列来预测末端氨基酸序列，可以确定每种子单元的C-末端氨基酸序列。图4显示的使用 AXIMA Performance 以高能CID （碰撞诱导解离）方法进行二级质谱分析得到的m/z 2504碎片峰 的例子。 12 图2 PfuRPA 蛋白混合物经LysC 酶解并TMPP 衍生产物的MALDI-TOF 谱图 图3 经DITC 树脂分离后的三种C-末端肽段MALDI-TOF 谱图 图4 自RPA14 分离所得C-末端肽段的二级质谱图 3. 结论 本文使用LysC 酶解蛋白样品，以TMPP-Ac-OSu 对酶解产物进行衍生化修饰，并用DITC 树脂进行分离后，以岛津AXIMA Performance 检测确定了蛋白C-末端氨基酸序列。 13