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质粒DNA提取及浓度纯度测定 质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1—200Kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在基本上不防碍细胞的存活，因此质粒是寄主性的自主复制因子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因带进受体细胞表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质。目前，质粒已广泛地用作基因工程中DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0—12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，由于共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质— HYPERLINK /yp/product-list-703.html \t _blank SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 实验中，在 HYPERLINK /yp/product-list-700.html \t _blank EDTA存在下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂 HYPERLINK /yp/product-list-703.html \t _blank SDS处理使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解，同时细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白、核糖 HYPERLINK /yp/product-list-430.html \t _blank 核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和 HYPERLINK /yp/product-list-471.html \t _blank 核酸酶可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇混合液的抽提可以去除蛋白质等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程产生的泡沫，并使离心后水层、变性蛋白质层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液可用乙醇或异戊醇沉淀，获得质粒DNA。 [仪器、材料与试剂] (一) 仪器和材料 恒温培养箱、恒温 HYPERLINK /yp/product-list-339.html \t _blank 摇床、台式 HYPERLINK /yp/product-list-47.html \t _blank 离心机、高压灭菌锅、紫外可见 HYPERLINK /yp/product-list-230.html \t _blank 分光光度计、移液枪、Eppendorf管、E.coli DH5α（pSC123）菌株 (二) 试剂 质粒DNA提取试剂： 溶液I：50mM 葡萄糖 25mM HYPERLINK /yp/product-list-702.html \t _blank Tris·Cl (pH8.0) 10mM HYPERLINK /yp/product-list-700.html \t _blank EDTA (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.2M NaOH 1％ HYPERLINK /yp/product-list-703.html \t _blank SDS 用前等体积混合 溶液Ⅲ：5M乙酸钾60mL 冰乙酸11.5mL 水28.5mL TE缓冲液：10mM HYPERLINK /yp/product-list-702.html \t _blank Tris·Cl (pH8.0) 1 mM HYPERLINK /yp/product-list-700.html \t _blank EDTA(pH8.0) 乙醇 70％乙醇(放—20℃冰箱中，用后即放回) LB液体培养基 [实验步骤] (一) 提取质粒 1、接种一个单菌落于5mL含相应 HYPERLINK /yp/product-list-671.html \t _blank 抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至饱和状态（OD600=4）或过夜。 2、取1.5mL培养物倒入微量 HYPERLINK /yp