单克隆抗体制备流程.doc

单克隆抗体的制备流程 　　（一）动物的选择与免疫 　　1．动物的选择 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 免疫方案 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 　　初次免疫 1×107/0.5ml ip 　　↓2～3周后 　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip 　　↓3周后 　　加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv 　　↓ 　　取脾融合 （二）细胞融合 1．细胞融合前准备 （1）骨髓瘤细胞系的选择： 骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 （2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。 2．细胞融合的步骤 （1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。 与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周 ↓ 拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管） ↓ 反复冲洗，吸出冲洗液 ↓ 冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min ↓ 用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml ↓ 加入96孔板，100μl/孔 ↓ 放入37℃ CO2孵箱培养 （2）制备免疫脾细胞 最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死 ↓ 无菌取脾脏，培养液洗 一次 ↓ 脾脏研碎，过细胞筛 ↓ 离心，细胞用培养液洗2次 ↓ 计数 ↓ 取108脾淋巴细胞悬液备用 （3）制备骨髓瘤细胞 取对数生长骨髓瘤细胞离心 ↓ 用无血清培养液洗2次 ↓ 计数，取得×107细胞备用 （4）融合 ①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 ②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。 ③加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。 ④离心，800rpm, 6min。 ⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。 ⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。 ⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。 （三）选择杂交瘤细胞及抗体检测 1．HAT选择杂交瘤细胞 　　　脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。 在用HAT选择培养1～2天内，将有