实验一分光光度技术与蛋白含量测定.pptVIP

实验一;理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造 实验 利用分光光度计进行蛋白质定量测定 1.双缩脲法测定蛋白质含量 2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.紫外分光光度法测定蛋白质含量 ;分光光度技术（Spectrophotography）; 一、基本定义 利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 。 应用：定性、定量 优点：灵敏度高 精确度高 操作简便、快速 ;二、工作原理 1.物质对光线有选择性吸收作用。 2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比。 ; 如何定性？ — 利用吸收光谱鉴定化合物; 1. 朗伯（Lambert）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。 I/I0=e-K1l I0 :入射光强度； I :透射光强度；l ：介质厚度;2．比尔（Beer）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。 I/I0=e-K2C I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 ;3.Lambert-beer’s law的合并 一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 I/I0=e-εcl A=-lg I/ I 0=εcl A：吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度 ε：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为 mol/L,光程为1cm时的消光系数;4.计算 （1）标准管法（标准比较法） 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准=ε标准C标准L标准 A样品=ε样品C样品L样品 A：吸光度；ε ：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度; 因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品= ε标准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准 故上二式可写成： A标准/A样品= ε标准C标准/ ε样品C样品 C样品=A样品/A标准 × C标准;（2）标准曲线法 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。 以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。 ;标准曲线使用注意事项;5．应用中注意的问题 ① Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符 ② 选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干 扰 ③ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。; 空白管： 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。 测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。;分光光度计;一．基本部件 1．光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯 (或氘灯)。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨 灯；在紫外光区，多使用氢灯。 2．单色器 棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。 3．吸收池（比色皿、比色池） 选用合适的比色皿（可见 光—玻璃；紫外光– 石英；规格、新旧程度一致） 4．检测器 5．测量装置 ; 二. 分光光度计使用步骤（示教） 三. 使用时注意事项 1. 波长选择。 2. 机器预热。 3.