贵州特有药用植物根际菌根真菌多样性研究.docVIP

　　贵州特有药用植物根际菌根真菌多样性研究 封晔 FENG Ye （贵阳职业技术学院，贵阳 550081） 摘要：采用T-RFLP法实验研究贵州省特有药用植物根际丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多样性。结果表明： 4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。植物种类不同，对应的AMF群落多样性有较大差异，证明了宿主植物对根际微生物群落结构多样性的影响；同时，有机质、pH和速效磷对根际ＡＭＦ群落多样性影响较大。 .jyqkycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最广泛的一类。研究表明，AMF因其能扩大植物根系吸收面积、加快养分运输速率、分泌活化物质、提高光合速率等直接和间接作用，改善宿主植物的矿质营养，增加植物中的碳积累，进而促进植物生长[2]。 目前对药用植物AMF的研究主要集中在菌根多样性或接种菌根真菌对植物的影响。李品明等对重庆市13种中药材植物的AMF物种多样性进行了研究，结果表明，从中药材植物根际土壤中分离出了10种菌根真菌，隶属三个科[3]。王森等以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料，从4种植物根际共鉴定AMF 27种[4]。在国内因药用植物种质资源丰富，宿主范围十分广泛，目前已经对上百种药用植物进行了研究。 长久以来，中药材大多来自野生药用植物，但随着对药用植物需求的不断增加，野生药用植物已经无法满足人们对药用植物的需求，甚至濒临灭绝，加之人工栽培技术落后、栽培措施不配套等原因，导致药用植物种质退化、质量下降、入药性质不稳定等。本课题主要是通过对贵州特有药用植物根际土壤采集和分析，研究药用植物根际AMF种质资源及多样性，以期为充分发掘和利用AMF资源，筛选AMF优势菌，利用菌根生物技术提高药用植物产量、品质和扩大人工栽培区提供材料和依据。 1 材料与方法 1.1 研究地概况 采样地位于贵州东南部茂兰保护区及织金县牛场镇。本区处于温暖湿润的中亚热带气候区，区域内有雷公山和月亮山，分布着适宜常绿栎林及热带常绿阔叶林生长的红壤和红黄壤，海拔最高处为2178．8m，最低处137m。区域内有中草药资源十分丰富。 1.2 样品采集 2014年10月在贵州省茂兰保护区及织金县牛场镇采集铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、太子参（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根际土。每株按东西南北4个方位，除去5cm厚的表层土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取带有细根的根系，用塑胶袋存放根系和根际土样品。经检测，土样基本性质如表1所示。 1.3 AMF的形态观察及其侵染能力的检测 采用Philips和Haymay染色方法进行观察和计算。 1.4 分子生物学方法分析样品多样性 1.4.1 总DNA的提取和纯化 采用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤总DNA。 1.4.2 PCR扩增 采用由大连宝生物公司合成的引物AM1 和NS31扩增18SrDNA施测。反应体系为20ml.PCR扩增产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检验。 1.4.3 群落多样性分析 采用T-RFLP方法分析样品，以图谱中每一个限制性片段（T-RF） 为一个OTU，测定OTU数目即为物种丰富度指数（S），峰高值低于100荧光单位的峰不计入分析范畴。根据丰富度指数（S）和相对峰高值（Pi）测定均匀度指数（E） 和Shannon多样性指数（H）。 相对峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N 均匀度指数（E）：E＝H/lnS Shannon指数（H）：H＝－∑PilnPi 式中，N为该样品所有累计峰高，ni为第i个T-RF峰值。 1.5 数据分析 用表3中的实验数据代入EXCEL（2003）、SPSS（V17.0）软件系统进行汇总和分析。 2 结果与分析 2.1 根际AMF的形态及其侵染率 从表2中可见，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四种植物中铁皮石斛的菌根侵染率最高，丹参最低。对比采样环境可以看出，侵染率与土壤性质有一定相关性。其中pH越高侵染率越高；侵染率与速效磷和速效钾呈反比。 2.2 群落多样性 2.2.1 样品总DNA提取和基因的扩增结果 从土壤中提取出的总DNA粗提样品中有大量黑褐色杂质，基因组片段大小为20 kb，用1%琼脂糖电泳检测，条带明亮齐整，这说明所得到的微生物总DNA比较完整。扩增的18 SrDNA基因片段长度为550 bp。 2.2.2 群落多样性指数 表3可见，4个样品的根际AMF多样性存在明显的差异。其中，丰富度指数