多糖分离纯化方法及应用实例.PDF

2009-8 volume30 多糖分离纯化方法及应用实例 多糖的应用现状 近20 年来,随着天然药物化学、药理研究的不断深入即分析手段突飞猛进的发展,多糖 的研究引起了国内外许多学者极大的兴趣。研究表明, 多糖具有复杂的多方面的生物活性 和功能,特别是对机体免疫功能的作用。现在多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组 成部分。 作为药物的多糖在治疗肿瘤时,不像一般化疗药物直接杀死生长着的肿瘤细胞,而是促 进细胞和体液免疫反应,如激活补体、巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞或加强抗体生成 等, 以达到抑制和消灭肿瘤细胞的作用,对正常细胞影响很小。 例如：紫草和枸杞多糖具有抗突变、抗衰老和增强免疫功能的作用;枸杞多糖等可抵抗 自由基过氧化；香菇、商陆、松果、柴胡和云芝多糖可激活巨噬细胞,从而抑制肿瘤生长; 从三七、防风、甘草和刺五加中提取的多糖类化合物能激活网状内皮系统,发挥抗肿瘤作用; 灵芝多糖通过活化巨噬细胞和蛋白激酶C (PKC)而发挥免疫增强作用等。目前, 已有部分天 然多糖类化合物用于临床,显示出良好的疗效,多糖在治疗肿瘤、代谢及感染性疾病等方面 的应用仍在不断扩大,给近代肿瘤、艾滋病及其他疾病的治疗开辟了新的方向。 因此，许多学者也纷纷开始研究多糖，而多糖的分离纯化也成为了研究多糖不可或缺 的步骤。选择合适的分离纯化多糖填料尤为重要。 多糖的分离方法 尽管多糖来源不同、品种繁多，但其分离纯化的方法基本类似，主要是利用多糖溶于水 或酸、碱、盐溶液，而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点。提取时，一般应先将植物原 料脱脂和脱色素，然后以水为主体溶剂（如冷、热或稀的酸、碱溶液）提取多糖。提取液以 醇、丙酮等沉淀析出，所获得的粗多糖需经反复溶解与醇析。对于含糖多的苷类也可采用此 法得到总苷。 2009-8 volume30 糖类提取之后需要进一步除去大量的非糖杂质，再进行混合糖类的相互分离，这是一项 比较困难的工作，尤其是多糖类难以获得纯品。一般可采用下列方法分离纯化混合多糖。其 中柱层析法是目前采用比较多的方法。 部分沉淀法  金属盐沉淀法 提取液中加入中性醋酸铅可沉淀去除大部分酸性、酚性的杂质（如有机酸、氨基酸、蛋白质、 树脂酸、黄酮、蒽醌、鞣质等），包括酸性多糖。而用碱式醋酸铅对多糖的沉淀就更为完全。 除去杂质后的母液用H2S脱盐后，单糖、低聚糖和水溶性较大的中性苷类仍保留在滤液中。 铅盐沉淀法除去杂质比较完全，母液脱铅后可用于单糖和低聚糖的定量，也可用铜盐沉淀法 提取多糖。  季铵盐沉淀法 季铵类氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于分离酸性多糖。季铵氢 氧化物与中性多糖不生成沉淀，但当调高PH，使某些OH基解离，或加硼酸缓冲液增高糖的 酸度，中性糖也能被沉淀。利用季铵氢氧化物在酸性、中性、微碱性、碱性中分级沉淀可以 分离多糖。  甲醇分级沉淀法 常用的分级沉淀法是在混合多糖的浓水溶液中（常在PH=7时），逐步加入乙醇，收集不同醇 浓度下析出的沉淀。一般各次沉淀需经反复溶解后，再醇析，直到测得的物理常数恒定，最 常用的是旋光度测定和电泳检查。用分级沉淀法得到的多糖，常杂有较多的蛋白质，必须予 以去除。一般选择那些使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸 等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。 透析、超滤及超速离心 选用不同规格的超滤膜和透析带进行超滤和透析, 以及一定条件下的超速离心操作,可按分子 大小差异把多糖样品分级。超滤和透析更常用于除去小分子物质。 2009-8 volume30 制备性区域电泳 在电场作用下，不同的多糖按其分子大小、形状及其所带电荷的不同而达到分离。载体通常 是玻璃粉。电泳完毕后，将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱。此法分离效果较好，但 只适于实验室小规模应用。常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维塑膜电泳。 柱层析法 凝胶过滤层析 它是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离的目的，已用于各种植物淀粉中直链和支链 多糖的分离。常用的凝胶色谱分离材料主要有葡聚糖凝胶（sephadex G、sephadex LH-20 ）, 琼脂糖凝胶（sepharose ）,纤维素凝胶（cellufine GCL-2000 ）,聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P ）等。 在色谱分离时，大分子的多糖比小分子先洗下来。对于分子量较大的多糖，选择的sepha