SeamlessCloningKit（无缝克隆试剂盒,试用装）.PDF

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-168-3301或800-8283301 订货e-mail ：order@ 技术咨询：info@ 碧云天网站 微信公众号 网址： Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒, 试用装) 产品编号 产品名称 包装 D7010FT Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒, 试用装) 5次 D7010S Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒) 20次 D7010M Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒) 100次 产品简介：  碧云天生产的Seamless Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)是一种新型的基于插入片段和线性化载体的末端进行同源重组的基因克 隆试剂盒。本试剂盒利用包含了DNA 5'外切酶(5' Exonuclease) 、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA连接酶(DNA Ligase)活 性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确地插入到 线性化载体中，并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此被称作“无缝克隆”。  和传统的基因克隆方法相比，本试剂盒的无缝克隆方法有多方面的突出优点：(1) 最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列， 因此是真正的“无缝克隆”；(2) 可通过一个反应将一个或多个片段快速、定向地插入到载体的任何位置；(3) 待插入的PCR 扩增产物无须酶切；(4) 插入片段的大小范围宽，从20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5) 可通过PCR 扩增获得线性化载体，因此限制性内切酶消化并不是克隆所必须的；(6) 酶催化的重组连接反应非常快速和高效，对于一个 片段的插入仅需50ºC处理15分钟；对于三个片段的插入仅需50ºC处理30分钟，而对于5个片段的插入也仅需50ºC处理约60分 钟；(7) 只有插入片段和线性化载体的末端才能发生同源重组，可以有效避免非特异性的同源重组；(8) 阳性克隆比例高， 单个DNA片段克隆的阳性率几乎为100%，三个片段的克隆阳性率约为70-80%。  本无缝克隆试剂盒操作非常简单。本试剂盒进行基因克隆时没有酶切位点的限制，仅需在载体的预定克隆位点通过酶切进 行线性化或通过PCR 的方法直接制备线性化的载体，在插入片段的两个PCR 引物的5'端引入与载体克隆位点两端完全一致的 15~25bp 的重叠序列。重组反应可以在50ºC快速进行，3-4小时内即可完成从DNA样品的PCR扩增、纯化、重组、到转化涂板 的全部操作。其中PCR反应约2-3小时，PCR产物纯化约20分钟，重组反应15分钟，转化涂板约40分钟，共计约3-4小时即可 完成。  碧云天无缝克隆试剂盒的工作原理示意图请参考图1。 图1. 碧云天无缝克隆试剂盒的工作原理图。重叠区域(overlap region)的DNA 序列完全一致，通常长度为 15-25bp 。不同颜 色的重叠区域代表不同的重叠序列。在插入 2 个或以上片段时，不同的重叠序列可以确保待插入片段有序地插入到线性化 的载体(linearized vector) 中。  本试剂盒用于