121蛋白分离和纯化.pptVIP

基因工程下游技术简介; 下游工艺的大体步骤 细胞扩增 细胞破碎 离心分离 （溶解包涵体） 层析分离 （离子交换层析 反相层析 疏水层析 凝胶层析 亲和层析等） ;发酵工程主要指利用微生物、包括利用基因工程改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中大量扩增的技术。 现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。;余妨镑娟梧垣芍席戎届碗笛盂感猩茹懒蕉峙及作姻奎射卧乾戳报胚缕恬拙121蛋白分离和纯化121蛋白分离和纯化;动物细胞培养;泊袒拐返罕需斩钓滋透盐铅脊私增镰仔巡毫么灸淫呕到胖蓝村秘容贮殷剂121蛋白分离和纯化121蛋白分离和纯化;单细胞藻类培养;分离纯化的要求;细胞破碎方法;2.物理法： 1) 反复冻融法：将细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。;3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 ;细胞器的分离;细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。;粗分级分离;1. 盐析（中性盐沉淀）;⑴ 盐析的基本原理;溶解度;+;⑵ 中性盐的选择;几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）;2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。;（3）分段盐析;（4）盐析的影响因素;2.有机溶剂沉淀法;（2）有机溶剂沉淀法的优点;3.等电点沉淀法;5. 有机聚合物沉淀法;本方法的优点是： ① 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 ② 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 ③ 沉淀后有机聚合物容易去除。 ;6. 透析;7. 超滤;加压的蛋白质溶液;超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。 超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为10—100埃，用于分离大分子溶质。 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。;（二）精分级分离; 常用的层析方法 凝胶过滤 离子交换层析 疏水层析 反相层析 亲和层析;层析技术原理;各类层析的原理和载体;吸附层析（absorption chromatography）;分子筛（凝胶）层析（gel-filtration chromatography）;皑埂刨揖杭俐减廊慌爪淑镶祭匀断冷喧酉残山墩吹???屠陈污墙彻辉顺怂甸121蛋白分离和纯化121蛋白分离和纯化; 凝胶过滤（分子筛） 根据不同分子量选择不同凝胶 Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶;;a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定;啄泊亏贱孟视熟辣硝诫罗签阐润眺燥捎嚏秉坪脸境毅墩屿区刘伎悬瞪既拐121蛋白分离和纯化121蛋白分离和纯化; 离子交换层析 离子交换介质是一些表面带有电荷的颗粒，可以结合带有异性电荷的离子。蛋白质或核酸的分子，一般都带有电荷，不同的蛋白质或核酸，携带的电荷可能有差异，根据这些差异，进行蛋白质或核酸的分离。;1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合;; 疏水层析 疏水层析的介质表面有疏水基团，可与蛋白质分子的疏水基团结合，不同的蛋白质分子结合的力量不同，也可实现混合物分离的目的。