RNA提取的原理.docVIP

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。 异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。 氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用 。 通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧。 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。 Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈手摇才行，这样才能彻底地两相混匀。而且DNA在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。 醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。 l楼主问的问题，我的个人理解是： 前面提取的RNA经异丙醇沉淀后，总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子，这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话，就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。为此，就需要用70%乙醇洗涤沉淀(因为在70%乙醇里RNA是不溶的,而一些蛋白和其它杂质分子却可溶),并且最好是洗涤2次，然后高速离心后，倒去上清，即可得到较纯的RNA沉淀。用无水乙醇则达不到这个目的!。 以下是我个人提取RNA时的操作总结，不正之处，请战友指正！ 1.1 匀浆 1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入0.75 ml TRIZOL试剂，每个大鼠的腺垂体从-80°C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器（瑞士）进行匀浆。 【注：1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL，样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。 2. TRIZOL试剂用前应于4°C保存，操作时应带手套和口罩。3. 匀浆器头用前需在3% H2O2（DEPCC水配）里浸泡，然后于0.1% DEPC水中空转2次，最后于TRIZOL试剂中空转2次，方可用于匀浆。4. 匀浆时间不宜太长，转速不宜过大，刚开始时由慢到快至中档处，然后减速，重复1-2次，未见有组织碎块即可．５．如果样品数多的话，可先将TRIZOL试剂一并加好，然后逐一加入样品匀浆。６.　特注：每加完一种试剂，都应及时盖上管盖，夹取管子或者打开管子时，尽可能不要碰到管的内缘。】。 2) 将匀浆样品置于15-30°C下静置5分钟，以使核酸蛋白复合物完全分离。如果所提取的组织中含有较多的蛋白、脂肪等，则应在匀浆结束后将匀浆液于4°C，12000 g，离心10分钟，取上清用于以下操作。 【注：如果此匀浆液暂时不用于实验，可于-80°C下保存至少1个月。】 1.2 RNA 提取 1) 加0.15 ml氯仿（每1 ml匀浆液加0.2 ml氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，于15-30°C下静置3分钟。 【注：如果样品数多的话，可先于一个无菌的离心管中倒入适量的氯仿，而勿需每次从大瓶子里吸取，这样可以减少污染，亦可加快速度】 2) 4°C，12000 g，离心10分钟。 3) 小心吸出上层无色溶液（约为匀浆液体积的60%）于另一个1.5 ml无RNAase的离心管中。 【注：此步非常需要注意的是，在吸取上清时，切勿切勿将中间和底层的有机相吸出，宁愿少吸一点上清。同时，最好是用小枪头吸，这样就可以保证不吸到中间相】 4) 加无RNAase的糖原10 μg（终浓度约为250 μg/ml，最多不能大于4 mg/ml），盖好管盖，充分振荡后，加入等体积的异丙醇（约400 μl），室温静置10分钟。 【注：1. 糖原应不含RNAase，其作用是能够携带液相RNA溶液，有助于其沉淀。2. 在4°C下静置容易使其它不重要的物质沉淀下来