1假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶在酿酒酵母上的表面展.PDFVIP

目 录 引言1 1 假单胞菌WBC-3 甲基对硫磷水解酶在酿酒酵母上的表面展示2 1.1 材料2 1.1.1 菌种与质粒2 1.1.2 培养基3 1.1.3 分子生物学酶及试剂3 1.2 方法4 1.2.1 甲基对硫磷水解酶基因的克隆及鉴定4 1.2.2 pYD1-MPH 重组质粒的构建及鉴定6 1.2.3 酿酒酵母EBY100 转化及转化子筛选7 1.2.4 表面展示甲基对硫磷水解酶的诱导表达及酶活测定8 1.2.5 细胞免疫荧光检测9 1.3 结果10 1.3.1 甲基对硫磷水解酶基因片段的扩增10 1.3.2 重组质粒pYD1-MPH 的构建11 1.3.3 表面展示甲基对硫磷水解酶活力的测定11 1.3.4 细胞免疫荧光检测12 2 表面展示甲基对硫磷水解酶酶学性质研究13 2.1 材料13 2.1.1 菌株13 2.1.2 培养基13 2.1.3 试剂13 2.2 方法13 2.2.1 表面展示甲基对硫磷水解酶最适反应 pH 和 pH 稳定性13 2.2.2 表面展示甲基对硫磷水解酶最适反应温度和温度稳定性14 2.2.3 不同金属离子对表面展示甲基对硫磷水解酶活性的影响14 2.3 结果14 2.3.1 表面展示甲基对硫磷水解酶最适反应pH 值和pH 值稳定性15 I 2.3.2 表面展示甲基对硫磷水解酶最适反应温度和温度稳定性15 2.3.3 不同金属离子对表面展示甲基对硫磷水解酶活力的影响16 3 全细胞酶降解甲基对硫磷的研究17 3.1 材料17 3.1.1 菌株17 3.1.2 培养基17 3.1.3 试剂17 3.2 方法17 3.2.1 水体中甲基对硫磷降解研究17 3.2.2 全细胞酶的重复利用性研究17 3.3 结果17 3.3.1 全细胞酶降解水体中甲基对硫磷17 3.3.2 全细胞酶的重复利用性18 4 结论与讨论18 4.1 结论18 4.2 讨论19 参考文献21 附录A 本年度发表论文情况23 II 插图清单 图1 甲基对硫磷水解酶基因PCR 扩增产物电泳图 10 图2 重组质粒pYD1-MPH EcoRI 、XhoI 双酶切鉴定 11 图3 对硝基苯酚标准曲线 12 图4 免疫荧光检测表面展示的甲基对硫磷水解酶 13 图5 不同pH 对表面展示甲基对硫磷水解酶的活性和稳定性的影响 15 图6 不同温度对表面展示甲基对硫磷水解酶的活性和稳定性的影响 16 图7 不同pH 的淡水中甲基对硫磷的降解率 18 附表清单 表1 不同金属离子对表面展示甲基对硫磷水解酶活力的影响 16 表2 全细胞酶的重复利用性 18 III 引言 有机磷农药是全世界也是我国目前使用最广、用量最大的高效广谱杀虫剂之 一。甲基对硫磷是一种高毒的有机磷农药，使用后残留期长，是一种持久性有机 [1] [2,3] 污染物 ，在国内水源和食物中时有检出 。甲基对硫磷作为一种神经毒剂，可 通过抑制生物体内乙酰胆碱酯酶的活性而造成乙酰胆碱累积，引起神经功能紊 [4] 乱，严重时导致个体死亡，对生物体有较大的毒害作用 。 甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion h