ApoE基因缺陷小鼠CuZnSOD基因CpG岛甲基化探究.docVIP

ApoE基因缺陷小鼠CuZnSOD基因CpG岛甲基化探究【摘要】 目的 检测apoE基因缺陷小鼠肝脏CuZnSOD基因CpG岛甲基化状态，探讨其与动脉粥样硬化发生发展的关系以及在动脉粥样硬化早期基因诊断中的意义。方法 ApoE基因缺陷小鼠是用来建立动脉粥样硬化的成熟模型,本实验将18例7周龄apoE基因缺陷雄性小鼠及作为对照的18例7周龄正常的C57BL/6J雄性小鼠分别随机分成三组,在饲养至0周、7周、14周时取其肝脏，运用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）法检测肝脏CuZnSOD基因CpG岛甲基化情况。结果 不同时间段apoE基因缺陷小鼠与正常的C57BL/6J小鼠CuZnSOD基因CpG岛甲基化差异无统计学意义。结论 apoE基因缺陷小鼠肝脏没有发生CuZnSOD基因启动子区CpG岛的异常甲基化，可能CuZnSOD基因启动子区CpG岛的异常甲基化没有参与动脉粥样硬化的发生发展。? 【关键词】 动脉粥样硬化；CuZnSOD；甲基化 ? DNA甲基化是DNA分子复制后的一种共价修饰方式，导致DNA结合蛋白与DNA主螺旋沟的结合能力降低，从而在不改变基因结构的基础上够调控基因的表达。本研究运用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）对apoE基因缺陷小鼠与正常的C57BL/6J小鼠肝脏CuZnSOD基因启动子区CpG岛甲基化状态进行检测，以探讨CuZnSOD基因甲基化与AS发生发展的关系。? 1 材料和方法? 1．1 标本来源 本研究采用7周龄雄性apoE基因缺陷小鼠，该小鼠购自美国Jackson实验室，由中山大学北校区实验动物中心繁殖提供；此外本研究还采用7周龄雄性C57BL/6J小鼠（清洁级）为对照，由中山大学北校区实验动物中心提供。将18只7周龄apoE基因缺陷小鼠和18只正常的7周龄C57BL/6J小鼠饲养一周以适应环境后随机各分成三组，将第一组小鼠处死，余以AIN-93G饲料分别饲养至第7周和第14周处死，分离小鼠肝脏，－80℃冻存待测。? 1．2 试剂和仪器 95％乙醇购自安徽安特生物化学有限公司；氢氧化钠购自广州化学试剂厂；亚硫酸氢钠、氢醌购自Sigma公司；醋酸钠、醋酸购自汕头市化学试剂厂；无水乙醇购自天津富宇精细化工有限公司；DNA 提取试剂盒购自TaKaRa公司（日本）; Wizard plus sv minipreps DNA Purification system购自 promega公司；PCR引物由上海生工合成；PerfectShotTM Taq(Loading dye Mix)、50 bp DNA Ladder Marker购自Takara公司；琼脂糖购自西班牙Biowest；Tris碱购自Sigma公司；Na2EDTA．2H2O、硼酸购自天津市福晨化学试剂厂；分析天平（Swiss Mettler AE160公司）；-80℃低温冰箱（Japan SANYO 公司）；低温高速离心机（Germany eppendorf 公司）；梯度PCR仪（Germany Hybaid GmbH 公司）；BIO-RAD电泳仪、电泳槽（U．S．A Bio-Rad 公司）；凝胶成像及分析系统（France Vilber Lourmat 公司）。? 1．3 方法? 1．3．1 肝脏DNA的提取 将分离出来的肝脏取50 mg放入研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后加入650 μl solution A和0．9 μl 的RNase A1后，再研磨1 min。收集650 μl研磨好的组织匀浆移至2．0 ml collection tube中，加入1 ml的4℃预冷的solution C及400μl的solution B，弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于collection tube 的Filter cup中，12,000rpm离心1 min。最后12,000rpm离心1 min洗脱DNA，-20℃保存备用。具体实验步骤严格按照Universal Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRa)说明书进行。? 1．3．2 模版DNA亚硫酸盐修饰 取DNA 2 μg，加双蒸水至46．7 μl。然后加入3 mol/l NaOH 3．3 μl， 37℃水浴10 min，使DNA充分变性。加入10 mM氢醌 30 μl及3 mol/l NaHSO 3 52O μl(pH 5．0)（氢醌和NaHSO3要新鲜配制），在上面加矿物油100 μl，53℃孵育16 h。将处理过的DNA溶液转移至wizard column中过柱，加入54 μl双蒸水（65℃）洗脱DNA， 在虑液中