丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎影响.docVIP

丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎影响【摘要】 目的 探讨丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的疗效。方法 雄性SD大鼠36只随机分组,对照组、模型组及丹酚酸B治疗组各12只,对照组给予普通饲料,其余各组均给予高脂饲料。于12周处死模型组。治疗组每天以浓度为1 mg/ml的丹酚酸B溶液20 ml/kg灌胃,同时继续高脂饲料喂养,对照组以20 ml/kg蒸馏水灌胃,同时继续普通饲料喂养。于实验第24周处死剩余实验动物。测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)及肝组织丙二醛(MDA)含量,同时观察肝组织病理学改变,免疫组化法检测肝组织TIMP?1的表达,RT?PCR法检测肝组织TGF?β1mRNA的表达。结果 与正常对照组相比,模型组肝指数、血清ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA水平显著升高(P 1?4 肝脏生化指标测定 在相同部位精确称取肝脏1?0 g,加入预冷的生理盐水,在冰水中制成10%的均浆,4℃3000 r/min离心15 min,提取上清液,用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量(试剂盒购自南京建成生物工程研究所),所有操作均按产品说明书进行。? 1?5 组织病理学检测 福尔马林固定肝标本,石蜡切片进行HE染色,在光镜下观察肝脂肪变性和炎症活动情况。肝细胞脂肪变性判断标准:肝小叶未见脂滴肝细胞为阴性,脂滴肝细胞占肝细胞总数小于1/3为(+),1/3～2/3为(++),大于2/3为(+++),几乎均呈脂滴肝细胞为(++++)。炎症活动度计分标准参考Knodell提出的慢性肝炎组织学活动指数(HAI)进行计分,分为汇管区炎症(P),小叶内炎症(L),碎屑坏死(PN)及桥状坏死(BN,包括多小叶坏死)四项,每项依此计分为1、2、3、4分,因为BN、PN的严重程度与预后直接相关,故计分2倍于其他病变,计分公式为P+L+2(PN+BN)。? 1?6 免疫组织化学检测肝组织TIMP?1的表达 采用SP法作免疫组织化学染色,切片常规脱蜡、水化、抗原修复、脱水、透明、树胶封片。采用KL型免疫图象处理系统进行半定量指标判断:未见阳性细胞为(?),阳性细胞占肝小叶全部肝细胞的1/3以下为(+),1/3～2/3为(++),2/3以上为(+++)。为保证实验结果的可靠性,特别是免疫组织化学的特异性,本实验采用省略一抗和二抗,用PBS代替一抗作阴性对照。? 1?7 RT?PCR法检测肝组织TGF?β1mRNA的表达 采用美国GIBCO公司生产的一步法。? 总RNA提取试剂盒,TRIZOL试剂按说明书操作提取总RNA,PCR反应体系内含cDNA 2 μl、10хbuffer 5 μl、4хdNTP(2 mmol)2μl、TGF?β1、GAPDH引物各2 μl,Taq酶1U,超重水补至20μl。TGF?β1上游引物5CTT CAG CTC CAC AGA GAA CTG C 3’,下游引物5CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C 3’, GAPDH上游引物5CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATG G 3’,下游引物5CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG 3’。各取1μg总RNA抽取物加入此反应体系进行PCR循环,循环参数为:97℃ 2 min、94℃ 30sec、56℃30sec、72℃50sec,50次循环。取PCR扩增产物10μl加入2%琼脂糖凝胶中在TAE缓冲液50V 1 h电泳,溴化乙锭显色成像定量分析,结果经计算机图像灰度扫描数字转换后进行统计学处理,以目的基因条带光密度值与内对照GAPDH条带光密度值的比表示目的基因相对表达量。? 1?8 统计学方法 采用SPSS 11?5统计软件分析,计量资料采用方差分析,等级资料采用秩和检验。? 2 结果? 2?1 生化指标的检测:与对照组相比,模型组血清ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA等显著增高,治疗组较模型组显著下降。见表1。? 表1 各组大鼠生化指标的检测结果(x±s) 组别nALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)MDA(nmol/mg蛋白) 对照组1242?50±5?58112?43±16?720?82±0?321?32±0?272?36±0?24 模型组1272?48±8?32??a?215?53±29?83??a?1?36±0?44??a?2?15±0?42??a?4?82±0?57??a? 治疗组1239?16±8?25??b?102?26±18?41??b?0?73±0?53??b?1?16±0?54??b?2?68±0?8