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心内科病房空气中肠球菌污染状况监测[摘要]目的　探讨气栽肠球菌在心内科病房获得性医院感染中的作用。方法　采用国际标准Andersen-6级采样器和血平板在心内科病房针对气栽肠球菌进行采样，通过肠球菌培养、计数、鉴定分类，对肠球菌属的高度保守的tuf基因片段设计特异性引物。对所有的疑似菌落再进一步通过肠球菌特异性引物扩增进行检测。结果对分离菌株进行PCR扩增，均得到约为112 bp的特异性条带，大多数气载肠球菌主要分布在Andersen采样器的3-6层级上。结论　气栽肠球菌在院内感染中占有重要地位。 [关键词]院内感染；肠球菌；空气监测 [中图分类号]R122，1 [文献标识码]A [文章编号]1672-4208(2009)13-0022-02 医院获得性呼吸系统感染的发病率和死亡率占我国医院感染的第一位，所以，监测室内微生物气溶胶对于有效衡量病房空气质量、探讨多种疾病的发生、流行病学调查、评价生物安全设施的作用、控制医院获得性呼吸系统感染等具有重要意义。目前国外已经开始认识到监控室内微生物气溶胶污染的重要性，也开展了多方面的研究，我国在这方面的研究刚刚起步。本研究通过肠球菌培养、计数、鉴定分类，对肠球菌属的高度保守的tuf基因片段设计特异性引物(Entl，Ent2)，对所有的疑似菌落再进一步通过肠球菌特异性引物扩增进行检测，目的在于探讨气载肠球菌在院内感染中所占的地位。 1材料与方法 1.1 采样　采用国际标准Andersen-6级撞击式空气样品采样器和血平板在心内科病房针对气载肠球菌进行采样。 1.2 肠球菌的分离与生化鉴定　采集的血琼脂平板和血琼脂试条在37℃条件下需氧培养24-48 h后，凡是出现灰白色、湿润、边缘整齐的小菌落，呈α、β、γ溶血，革兰染色阳性，触酶、杆菌肽和CAMP试验均阴性，胆汁七叶苷和65g／L NaCl耐受试验阳性的菌株均可初步确定为肠球菌。 1.3 空气中肠球菌浓度计算　采集的样本经Andersen校正表校正后，根据通气量得到每立方米空气中的气载需氧活菌，按公式(1)进行计算。记录琼脂条上的菌落数，按公式(2)计算。 CFU／m3(空气)=平皿上菌落总数／28.3 L／mim×采样时间(min)×1000 (1) CFU／m3(空气)=琼脂条上总菌数／40 L／min×采样时间(min)×1000 (2) 1.4 肠球菌的PER快速鉴定　针对肠球菌属的高度保守的tuf基因片段设计特异性引物(Ent1，Ent2)，对所有的疑似菌落再进一步通过肠球菌特异性引物扩增进行检测。所用引物：上游引物Entl：5-TACTGACAAACCATrCAT-GATG-3’；下游引物End：5-AACTrCGTCAC-CAACCCGAAC-3’。其扩增片段长度为112 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系及扩增条件：10×buffer(MgFme)2μl；Mgck(25 mmol／L)1.2μl，DNA模板O.5μl，Taq酶(5 U／μl)0.3μl，dNTP(2.5 mmol／L)0.5μl，上下游引物(25 mmol／L)各0.2μl，双蒸水补足20μl。反应条件：94~C、3 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，30个循环；72℃、10 min，于4℃结束反应。PCR产物鉴定：PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭O.5μg／ml)上以溴酚蓝作指示剂于1×TAE中90 V电压电泳40min，在凝胶成像系统中观察扩增产物，以PCR产物出现112 bp条带的分离株为肠球菌。 1.5 空气中肠球菌浓度的计算　经过以上检测方法检测后，统计阳性菌落的数量，并根据公式(1)和(2)计算出每立方米空气中肠球菌的含量(CFU／m3)，最后将含20％甘油的脑心浸液肉汤培养物保存在-20℃冰箱中。 1.6数据统计　因为空气微生物数据的非正态分布性，所以气载细菌浓度采用中间值(Median)表示，同时用最大值与最小值反映样品间数值的波动范围，并采用SPSS 13.0软件对数据进行方差分析及差异性比较。 2 结果 肠球菌PCR方法鉴定结果：通过对分离菌株进行PCR扩增，均得到约为112 bp的特异性条带；而在相同条件下，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、双蒸水等均扩增不出此特异性条带。6级Andersen采样器各层级采集到的粒子空气动力学直径大小：第l层8.2 μm，第2层在5.O～10.4 μm之间，第3层在3.O-6.0 μm之间，第4层在2.0-3.5 μm之间，第5层在1.O-2.O μm之间，第6层8.2μm)。 3 讨论 肠球菌是存在于人类或动物胃肠道的正常菌群，偶