蒿芩清胆加减方含药血清诱导Lewis肺癌细胞分化探究.docVIP

蒿芩清胆加减方含药血清诱导Lewis肺癌细胞分化探究（成都中医药大学，四川,成都,610075） 【摘要】 目的：观察蒿芩清胆加减方含药血清对Lewis肺癌细胞的分化诱导作用,并初步探索其作用机制。方法：蒿芩清胆加减方含药血清,体外培养Lewis肺癌细胞,通过不同浓度血清作用于细胞进行干预.观察给药后细胞形态学变化。用MTT抑瘤实验,琥珀酸脱氢酶（SDH）,乳酸脱氢酶（LDH）的测定,细胞周期的测定,观察细胞分化的情况。结果：光镜下血清组培养瓶中贴壁细胞数量呈减少趋势,以高剂量组细胞形态和数量改变趋势明显。MTT比色法显示含药血清浓度越高,抑制作用越强.SDH活性显示蒿芩清胆加减方血清组系使Lewis肺癌细胞内的SDH活性明显上升,并以高剂量组作用最为明显。LDH活性显示蒿芩清胆加减方血清高剂量组降低细胞内LDH活性最明显。结论：蒿芩清胆加减方含药血清作用于Lewis肺癌细胞株后,细胞具有向正常细胞生理状态分化成熟的趋势。 【关键词】蒿芩清胆加减方；Lewis肺癌细胞；分化诱导；含药血清 【中图分类号】 R285.5【文献标识码】 A【文章编号】 1005-1074(2009)04-0002-02 蒿芩清胆汤出自《重订通俗伤寒论》,由青蒿脑、淡竹茹、仙半夏、赤茯苓、青子芩、生枳壳、陈广皮和碧玉散组成。目前对该方抗肿瘤研究不多,黄秀深教授经过长期临床用药发现,该方在与人参,苦参等益气扶正,清热解毒的中药加减化裁后,对肺癌,肝癌等各种恶性癌症有较好的治疗效果。为了解其作用机制,本次实验以诱导Lewis肺癌细胞分化进行研究。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验细胞株 Lewis肺癌细胞株由成都中医药大学病理实验室提供。 1.1.2 实验动物与药品 健康SD大鼠,体重200～220g,雌雄各半,由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号：川实动管97(质8)号。蒿芩清胆加减方各中药均购于北京同仁堂成都分店。按常规煎煮法制成每1ml蒿芩清胆加减方含1g生药浓度药液；RPMI1640培养基,GIBCO公司；硝基四唑氮蓝（MTT）,Sigma公司；琥珀酸脱氢酶（SDH）测试盒,乳酸脱氢酶（LDH）测试盒,考马斯亮兰测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 1.1.3 给药 将SD大鼠随机分为蒿芩清胆加减方大中小剂量3个组和生理盐水对照组,每组12只.依据文献[1],蒿芩清胆加减方按临床成人（60kg）每天服用生药10倍给SD大鼠灌胃,即每天给药剂量＝人每天治疗剂量×动物等效剂量系数×10倍。每只每次给药2ml（每1ml水煎液含1g生药）,每日2次,连续3d,生理盐水对照组给以同剂量的生理盐水。 1.1.4 血清的制备 末次灌胃前禁食12h.末次灌胃后1h,股动脉采血,静置2h,3000r/min离心15min，分离血清,经56℃,30min灭活处理后,用0.45um微孔滤膜过滤除菌,置－20℃保存备用。 1.1.5 血清分组 实验共分为5组.将蒿芩清胆加减方含药血清分为小（5％）、中（10％）、大（15％）3组；生理盐水血清组及空白对照组。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞形态学光镜观察 取对数生长期细胞,以0.5×105个细胞/孔接种于6孔板,分组加药,培养6d,常规Wright－Giemsa染色；油镜下计200个细胞,观察其分化成熟度。 1.2.2 MTT抑瘤实验 取对数生长期细胞按2×103/ml接种于96孔培养板中,每组复设6个平行孔,每孔体积200ul，培养24h后给药组依次加入小（5％）、中（10％）、大（15％）含药血清,生理盐水组加等量生理盐水血清，空白对照组加等体积无血清RPMI1640培养基，培养48h,加MTT溶液,继续培养4 h后小心吸取培养液,以200ulDMSO溶解结晶,振荡10min后上酶标仪于波长490nm处测每孔的光吸收值（A）,并求出生长抑制率。 1.2.3 乳酸脱氢酶（LDH）的测定 取在对数生长期的Lewis肺癌细胞,分组加药，培养6d后收集细胞,匀浆机破碎，在波长440nm处测每孔的吸光度,按试剂盒说明操作，按公式计算细胞内乳酸脱氢酶活力。 1.2.4 琥珀酸脱氢酶（SDH）的测定 方法同上,在波长600nm处测每孔的吸光度,按试剂盒说明操作，按公式计算细胞内琥珀酸脱氢酶活力。 1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期的变化 以1×105个细胞/孔接种于6孔板中,药物处理细胞方法同上，细胞培养6d后,收集细胞(细胞数106个),用流式细胞仪分析。 1.2.6 统计学分析 所有实验均重复3次.结果采用SPSS12.0统计软件处理,组间计量资料采用单因素方差分析,计数资料采用卡方检