血浆EBVDNA水平动力学监测在鼻咽癌放疗过程中意义.docVIP

血浆EBVDNA水平动力学监测在鼻咽癌放疗过程中意义【摘要】 目的 探讨鼻咽癌患者在放疗过程中外周血EBVDNA水平的动态变化规律及与临床疗效的关系。方法 运用荧光定量PCR 技术动态检测44例鼻咽癌患者放疗期间血浆EBVDNA 水平,放疗期间每周的第1天检测1次;临床观察放疗过程中鼻咽部肿瘤消退情况与外周血 EBVDNA 水平变化的关系。结果 放疗完成2周时,血浆 EBVDNA阳性率及拷贝数较前显著下降,其余各周之间阳性率及拷贝数均无明显差异。放疗过程中血浆EBVDNAA水平变化表现为三种动力学曲线形式。每周临床观察鼻咽肿块消退情况发现:随着放疗剂量增加,鼻咽肿块逐渐缩小,血浆 EBVDNA水平逐渐下降。结论 放疗过程中血浆 EBVDNA 水平变化与鼻咽癌患者临床疗效关系密切,同时有可能成为监测鼻咽癌患者放疗后复发、转移的肿瘤标记物。 【关键词】 鼻咽癌;EBVDNA;荧光定量 PCR 作者单位:471003河南省洛阳东方医院放疗科 随着放疗设备和技术的改进、综合治疗的广泛应用,鼻咽癌的疗效有了明显提高,但仍有约30%~40%治疗后完全缓解的患者因复发或转移导致治疗失败。国内外学者研究发现血浆EB病毒(EBV)DNA水平在鼻咽癌的早期诊断、预后判断及监测治疗后转移、复发中具有重要意义[1,2]。本实验对鼻咽癌放疗期间血浆EBV DNA水平的动力学进行研究,明确放疗过程中患者外周血EBV DNA水平的动态变化规律与临床疗效的关系,为临床采用外周血进行治疗后监测提供参考。 1 材料和方法 1.1 临床资料 2005年6月至2007年12月在我科住院治疗的鼻咽癌患者按以下纳入标准选择入组:病理为鼻咽低分化鳞癌;初治患者;无远处转移;治疗前血浆EBV DNA为阳性。共收集44例病例,其中男34例,女10例,中位年龄50岁,Ⅲ期患者30例(68.18%),Ⅳ期患者14例(31.82)。治疗前均接受鼻咽、颈部CT扫描、电子鼻咽镜检、胸片、腹部B超及相关实验室检查以明确分期及除外远处转移。所有患者均接受体外根治性放疗,鼻咽部剂量70~76 Gy,颈部剂量66~70 Gy,颈部预防量50 Gy。 1.2 标本收集 所有患者在治疗期间每周的第1天采血1次,第1次采血时间为治疗前1周内,最后1次放疗前为放疗结束时。整个治疗过程中共采血8次,每次抽取外周血2 ml,加入EDTA抗凝管,离心后吸取血浆于-20℃冻存待测。共收集血样352份。 1.3 检测方法 运用荧光定量PCR法检测患者血浆EBVDNA水平。使用中山大学达安基因股份有限公司提供的EBV核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒,操作严格按说明书进行。 扩增的目的基因来自EBV EBAN-1片段(10?9151-10?9435),片段长284bp。上、下游引物分别为:5’-GTAGAAGGCCATTTTCCAC-3’、5-TTTC-TACGTGACTCCTAGCC-3。在PCR反应体系中加入一个双末端标记的荧光探针,探针序列为5-(FAM)ACCACCCGTGGCCCAGATGG(TAMRA)-3’。每批PCR 反应设置阴性对照,强阳性对照(1.0×10?6~2.0×10?7copies/ml),临界阳性对照(2.0×10?2~2.0×10?4 copies/ml),阳性标准品稀释成不同浓度梯度10?6、10?5、10?4、10?3、10?2 copies/ml),进行PCR扩增。PCR反应总体积50 μl,含有10 μl的5buffer,引物、探针各0.5 μl,dNTP共0.5 μl,Taq酶1 μl,DNA 模板5 μl,吸取抽提的DNA 5 μl 入PCR反应管中,在GE-5700 实时荧光定量PCR 仪中进行扩增反应,反应条件为93℃2 min,1循环; 93℃,45 s→55℃,60 s,10循环;93℃,30 s→55℃,45s,30循环。反应结束后,用计算机将样本和标准曲线对比,计算出反应体系中待测标本中的DNA 拷贝数。 1.4 临床疗效观察 治疗期间每周临床检查患者鼻咽肿瘤消退情况,在放疗完成40 Gy和70 Gy时行鼻咽CT及电子鼻咽镜检查以了解鼻咽肿块退缩情况。 1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS10.0软件进行统计学处理,统计学显著水平定为P 3 讨论 荧光定量PCR技术不仅具有PCR的高灵敏性,而且不需要扩增后处理,具有快速、准确、不易被污染的特点[3,4],为研究患者血浆EBV DNA水平提供了可靠手段。本实验通过每周血浆EBVDNA 阳性率及拷贝数分析发现,在放疗完成20 Gy时,77.27%的患者血浆EBVDNA 迅速下降至检测水平以下,这与其他学者的研究结果相似[5