血液病患者bcr-abl融合基因-Ph染色体异同浅议.docVIP

血液病患者bcr/abl融合基因\Ph染色体异同浅议【关键词】血液病；Ph染色体 CML特异性费城染色体(Philadephia，Ph)是由t(9：22) (q34：11)易位形成。9号染色体原癌基因abl(Abelson protooncogene)易位至22号染色体的断裂点簇集区(breakpoint duster region，ber)，发生重排，产生bcr／abl融合基因，引起CML的始动突变。融合基因bcr／abl几乎见于所有的慢性粒细胞性自血病、25％ 一50％ 的急性B系淋巴细胞性白血病 (ALL)和约5％ 的急性粒细胞性白血病中 J，本文统计了进行染色体和bcr／abl融合基因检查的初诊血液病66例，对其骨髓细胞染色体核型及ber／~l融合基因进行分析。 1 资料和方法 1.1一般资料 收集浙江省中医院2007年1月～2010年5月初诊血液病患者66例(男44，女22)，年龄(6―77)岁，平均44岁。其中慢性粒细胞性白血病48例，急性淋巴细胞性 白血病1I例，急性粒细胞性白血病3例，慢性淋巴细胞性白血病1例，淋巴瘤骨髓侵犯1例，白细胞增多症2例，以上病人诊断均参照《血液病诊断及疗效标准》拉J。 1.2仪器与试剂 美国Bio．RAD凝胶成像分析系统，美国ABI公司PE7000实时荧光定量F-CR仪，Thermal cycler 480DNA扩增系统，Trizol(invitrogen公司)逆转录试剂盒(上海宝诚生物工程大连有限公司)，引物为杭州晶大生物科技有限公司合成。 1.3染色体标本制备染色体榱本来源骨髓，肝素抗凝，采用直接法或24h短期培养法，收集有丝分裂中期细胞，采用R显带技术分析20个分裂中期细胞，核型分析或异常克隆 描述按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)(1995)》进行。 1.4bcr／abl融合基因测定取骨髓标本经肝素抗凝，用Ficol1分离液分离单个核细胞。Trrizol、氯仿-异丙醇法提取总RNA，进行RT―PCR，K562细胞株作为阳性对照。RT反应体系如F：RNA 2trg，Oligo―dT 1 ．，DEPC水补足10 ，70cc5min后加5mmol／L Tris―HCI 4 ，,~tNTP(10raM)2 ，Rnasin (40tr／ )O．5 ，DEPC水1．5 ，25(=【：5rain，加逆转录酶(M― MLV)1 ，混匀25~C 10min，42℃ 60rain，70~C 10rain。取逆转录产物4 进行PCR，扩增程序为：95℃ 预变性25min， 95℃ 1min、55~C 1min、72℃ 1min，35个循环72~C延伸10min， 16~C60min将扩增好的产物电泳，放入凝胶成像系统内扫描。 2结果 66例骨髓样本经显带法检测Ph染色体与RT―PCR方法检测融合基因后发现，45例 bcr／abl限性患者中染色体阳性为39例(86.67％)，48例Ph染色体阳性患者中ber／abl阳性有4J0例(83.33％)，阳性总符合率为85.05％。 3 讨论 Ph染色体(ber／ab1)是CML的标志物，9号与22号染色体发生遗传物质交换，产生ber／abl融合基因，导致一种异常融合蛋白p210(费城染色体编码融合基因产物)的产生 ]。由于融合蛋白酪氨酸激酶活性增强，干扰正常细胞程序，抑制细胞凋亡，导致细胞恶变，骨髓祖细胞大量增生，骨髓基质细胞黏附性下降，使大量不成熟的髓细胞释放于外周血，导致CML。CML实验诊断技术有细胞遗传学方法、荧光原位杂交技术、逆转录PCR(RT―PCR)、巢氏逆转录PCR、实时定量PCR法(real―time quantitative，RQ―PCR)等。细胞遗传学方法可识别典型和变异Ph染色体易位，还可检测多种染色体异常，但检测速度较慢、灵敏度较低。PCR方法有高度的灵敏性，可检测出微量的残留肿瘤细胞。Pl1染色体和bcrfabl融合基因检测为CML诊断提供了更为敏感和可靠的指标，但实际检测过程中，应注意标本的送检与处理，对最终结果的解释应结合细胞形态学结果和临床，仔细分析，并可进一步采用FISH技术对骨髓细胞中期分裂相或骨髓涂片直接进行ber／abl融合基因检测，从而给临床治疗和预后判断提供帮助。 参考文献 [1]Kurm~k R，Gutterman JV，T’,dpaz M．The molecular genetics ofphiladelphia chromosome positive leukemias[J]．N Engl J Med，1988， 319(15)：990-998． [2]张之南，沈娣，主编．血