个染色体区带特异性探针池的构建①-科学学研究.PDF

遗 传 学 报，21．）：253-256，1994 流ctaCeneticaSinica 4个染色体区带特异性探针池的构建① 夏家辉 杨 毅 戴和平 潘 乾 李麓芸 湖（南医科大学医学遗传学国家重点实验室 长沙 410078) 摘要 本文运用人类染色体显微切割和 PCR技术，成功地构建了14个染色体区带专特性探 针池，并通过染色体原位杂交证明它们均分别来源于相应的被切割的染色体区带。 关键词 探针池，染色体区带，显微切割,PCR,荧光原位杂交 人类细胞遗传学染色体显带技术的快速发展，使越来越多的疾病在染色体水平上找－ 到了原发性的改变，一些与疾病相关的基因被定位到人类基因组中一个较小的区域范围 内。1989年 Liidecke首次用显微切割 GTG一显带染色体标本经 PCR扩增成功，开创 了在染色体单条带水平定向克隆的新纪元111,Hampton3，邓汉湘Ell将其构建成探针池，并 用于染色体绘画。我室利用染色体显微切割、PCR技术成功地构建了 1g32,2g33, 5gl3,6p2l,8824.1,11g13,13q12,15q11、2一12,Ip36-3,1842,llg23-gter,17p13.2一pter,. 17g11.2,21g21.2-822.1共14个专特性探针池 (probepool）现报告如下。 1 材料和方法 1.1 区带染色体显微切割标本的制备 从培养的正常男性淋巴细胞株 (X-JHLC）中取 5m1细胞液加一倍培养液，置370C; 培养24小时，加人胸腺嚓淀 (Thymidine0.3mg/ml)同步培养17小时，洗脱释放5.5小· 时，加人秋水仙素 0（.4}tg/ml)30分钟，0.075mol/LKCl3m1低渗3分钟，用甲醇：冰 酷酸(3:1)固定40秒再用甲醇：冰醋酸(9:1)洗脱，干燥后将玻片标本置 pH7.4的磷酸缓 冲液 P（BS）洗二次，70务的乙醇洗二次，最后贮存于一30℃过夜，GTG显带，可获分裂 相多的320-550条带阶段的显微切割染色体标本。 1.2 染色体显微切割 在倒置显微镜下 O（lympus900X）寻找分散良好、待切染色体区域不受邻近染色 体干扰的中期分裂相。通过三维系统调控特制的经硅化的尖端直径约 0.17[1的玻璃针 定点切取22个 1g32,10个 2833,8个5gl3,35个6p21、la个8824.1,31个，lgl3, 12个 13g12,12个 15811.2-2,40个 1p36.3,11个 1g42,35个 l1q23-gter,25 个 17pl3.2--pter,12个 17g11.2和28个 2lg21.2--822.1的 DNA片段 （图版 1,1-a, b,c)，并将切割下来的染色体 DNA 片段转移至一个相邻的经硅化的洁净干燥的油室 里。 1.3 蛋白酶消化 用特制的尖端直径为 17-25V 的玻璃微吸管向切割的染色体片段加人2n1蛋白酶 ① 本文于1993年7月8日收到。本研究是8“计划资助项目 234 遗 传 学 报 2！卷 K(2mg/ml，日本）混合物，并向油室内注人用 IXSau3AI缓冲液充分饱和的石蜡油，当 石蜡油完全覆盖蛋白坑K混合液后，将油室放入培养皿中，置高湿度的370C培养箱孵育 名小时。 1.4 抽提 用微吸管向蛋白酶K混合液加人46倍体积的经 1XSau3AI缓冲液饱和的苯酚。 用微吸管反复抽吸巧次，以充分灭活蛋白酶K,然后吸去苯酚，重复上述步骤两次；将消 化球转移至另一油室，用2RI氯仿清洗消化球，使氯仿带着残余苯酚向石蜡油中扩散，更 换石蜡油，室温静置 1小时。 1．5 酶切 加入等体积的Sau3AI酶混合液 (4000units/ml)，置370C孵育6小时。用与抽提 蛋白酶K相同的方法或 70cC0.5小时灭活 Sau3AI内切酶的活性。 I．6 连接 加入等体积的引物一一连接体混合物 （12.5}tmol/L)，再加入等体积的T4DNA连 接酶 (5000-9000units/ml)混合液，160C孵育8小时。引物连接体是用 DNA合成仪 合成10个核普酸的连接体与24个核营酸引物1:1比例混合，58℃温育 1小时C17形成： 5 CGGGAATTCTGGCTCTGCGAC