东海原甲藻基因表达特征探究.pdf

东海原甲藻基因表达特征研究 摘 要 尽管东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）的命名仍存在分歧，但它是我国 特有的赤潮藻种，最近几年已在长江口和舟山群岛产生大规模的赤潮，造成了重 大的经济损失和给生态带来了重大的影响,由此引起人们极大的关注。 进年来, 有关它的生活史, 生态, 分类, 形态等研究很多, 但其分子生物 学研究却非常少。为了在东海原甲藻中开展相关的分子遗传学研究, 我们构建了 人工培养状态下的东海原甲藻对数生长期细胞的cDNA文库。 从随机选取的700 个克隆获得了 565 条可用的序列。本论文报道了从这些序列中鉴定的功能基因, 尤其是那些与细胞程序化死亡相关的基因。另外，我们还对线粒体细胞色素 b 基因 及细胞色素氧化酶亚基 I 基因进行了克隆与分析。 在东海原甲藻的 cDNA 文库构建中，使用 UNIQ-10 Trizol Total RNA Preparation Kit 来进行总 RNA 的提取，将 cDNA Synthesis Kit 和 PCR cDNA Library Kit 组合使用 进行 cDNA 的扩增，最后，将 cDNA 与 pMD 18-T 载体连接后转化到大肠杆菌 JM109 中。 鉴定功能基因的一个比较恰当的途径是表达序列标签分析。 实际上, 这样 的分析已经在许多真核生物中进行, 被认为在某中程度上发挥与全基因组测序 相同的作用。 表达序列标签就是一段 cDNA 序列, 能定义这些 cDNA, 但因为是 单方向测序产物, 不仅节约成本, 也能获得与全长基因相似的信息。它们除了作 为基因标签, 也能用来比较转录物集合, 做DNA芯片, 尤其是鉴定功能基因。我 们从东海原甲藻的cDNA 文库中随机挑取克隆进行测序，得到565条EST这些序 列可分为 272 个单一序列和 36 个重叠群(308 个 EST 组)。在蛋白数据库中比较 发现 23 组与已知功能蛋白相似的克隆，其中的大部分与能量代谢、转录/翻译 及光合作用有关。 有9组与甲藻中已知蛋白序列相匹配。 另有14组与其它生物体中的已知蛋 白序列相匹配。特别重要的是有两组EST分别与两个细胞程序化死亡的关键蛋白 同缘, 它们分别是半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶（cysteine proteases ）和分裂细胞 核抗体（proliferating cell nuclear antigen）。 赤潮形成浮游植物的繁殖和死亡是它们对应赤潮形成和消亡的微观过程。半 胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶的鉴定初步证明了东海原甲藻存在细胞程序化死亡 过程, 也为东海原甲藻的繁殖和死亡研究, 以及它形成的赤潮的爆发和消亡机 制研究打下了一定的基础。 被同时鉴定出来的还有一组代表分裂细胞核抗体蛋白的EST。该蛋白与包括 细胞程序化死亡在内的许多细胞过程相关. 如果没有该蛋白或者其浓度特别低, 细胞就会进入程序化死亡。同样, 它的鉴定也有助于我们理解东海原甲藻赤潮形 成的机制。 我们还以相应引物LA PCR 扩增了东海原甲藻线粒体细胞色素 b基因（cob ） 和细胞色素氧化酶亚基I基因（coxI ）片断，PCR 产物经 T 载体连接后进行克隆、 测序。得到的细胞色素 b基因(cob)片断为1052bp，其A,T,G,C含量分别为 45.9%， 18.6%,24.2%和 11.4%。细胞色素氧化酶 I 亚基基因（cox I ）片断为 1058bp，其 A,T,G,C含量分别为38.9%，17.9%,28.2%和15.0%。 GC含量明显高于AT 含量。 我们将这两个片断与 GenBank 数据库中的甲藻目其它甲藻的 cob 片断和 coxI 片 断进行了比较，发现甲藻的 cob 序列差异性相对明显，而 coxI 序列差异性较低。 结果表明：相对于甲藻线粒体细胞色素氧化酶I 基因，线粒体 cob 基因进化速度 较快。另外基于这两个基因序列构建了系统树，对甲藻之间的进化关系做了初步 分析。 关键词：东海原甲藻，cDNA 文库，表达序列标签（EST），细胞色素 b 基因， 细胞色素氧化酶亚基 I 基因 Study of the cha