南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341产适冷蛋白酶和低温适应性的研究.pdf

南极嗜冷菌Colwellia sp．NJ341产适冷蛋白酶及低温适应性的研究 南极嗜冷菌Colwellia sp．NJ341产适冷蛋白酶 及低温适应性的研究 摘要 南极具有独特的地理及气候特征，其主要特点是变化极大的光照辐射、季节 性的光照时间：常年极低的水温(通常在一1．8℃～2．O℃)，在冬季最低温度可以达 到一50℃：高盐度环境(海水中的盐度一般为34％o~35％o)，海冰中的盐囊和盐通 道的盐度可达到150％o，因此形成了一个酷寒、强辐射和高盐度的自然环境。为 了适应极端的环境，生存于其中的微生物必然具备了相应独特的生理生化和分子 机制。因此南极微生物不仅是研究在低温条件下生物适应性的极好材料，而且也 是获得在低温条件下具有较大催化能力的适冷酶类的最佳来源。对南极微生物及 其产生适冷酶的研究有着重要的生物学意义；同时，由于适冷酶能在低温下有效 发挥催化作用的特点，在生物工程领域有着广阔的应用前景。本研究以南极海冰 嗜冷菌Colwellia sp．NJ341为研究对象，对该菌株分泌的胞外适冷丝氨酸蛋白酶进 行系统的研究，同时对该菌株的低温适应性也予以初步探讨，以期为南极微生物 的深入研究和开发应用提供科学依据。 (1)采用水解酪蛋白平板法对本试验室保存的260株南极低温微生物产适冷 蛋白酶情况进行测定，发现107株具有蛋白酶活性，其中5株菌(NJ276、NJ341、 NJl6—70、NJ345、NJ5—9)所产的蛋白酶活性高于45U／ml。除NJ5—9菌株外，对 其余4株菌所产蛋白酶的部分酶学特性进行研究，发现蛋白酶的酶学性质及酶的 种类和数量在种间存在差异。菌株NJ276、NJl6—70分泌的蛋白酶接近中温蛋白 rRNA 酶，NJ341、NJ345分泌的蛋白酶属于适冷蛋白酶。随后，对5株菌进行了16S (Pseudoalteromonas sp．)；菌株NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwelliasp．)。 (2)以国内外研究较少且只分泌一种适冷蛋白酶的嗜冷菌Colwellia sp．NJ341 作为研究材料，进行酶的优化培养、分离纯化及酶学性质的研究。结果表明，菌 南极嗜冷菌ColwelliaNJ341产适冷蛋白酶及低温适应性的研究 sp ml／250 ml摇瓶；6％NaCI盐度对菌体的生长和产酶最有利：酪蛋白和柠檬酸钠分 别为培养基中最佳氮源和碳源；K+和吐温．80有利于产酶；氨基酸对产酶的影响 较小。在单因素基础上，首次将响应面分析法(RSM)应用到低温发酵培养中， 模拟出产蛋白酶的二次多元回归模型，确定了最优的发酵条件为：酪蛋白，5∥1； 柠檬酸钠，3．75胡；吐温一80，O．2g／1；酵母提取物，lg／l；NaCl，10g／l；陈海 h。通过验证试 水，1000ml；初始pH，7．5；温度，8℃；200rpm振荡培养96 验发现，产蛋白酶模型有较好拟合性，产酶量达到175U／ml，产酶稳定性好。这 些数据将为该酶的大规模发酵生产提供重要参数。 G．75 (3)通过硫酸铵沉淀、DEAE．SephadexA50离子交换层析、Sephadex Fast Flow阴离子交换层析四个主要分离步骤后，嗜 凝胶过滤和DEAE．Sepharose 冷菌Colwelliasp．NJ341适冷蛋白酶纯化物总蛋白为0．4 mg；酶的总纯化倍数达 31．3倍；总