继代悬浮.ppt

三、植物细胞培养生产次级代谢产物 （一）细胞株筛选 细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。 细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株(Substrain)。 细胞株指标 （1）分散性好，适合大规模悬浮培养。 （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。 （3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。 （4）目标产物含量高，容易分离提取。 （5）细胞遗传稳定。 适合工业生产用细胞株的一般筛选流程 1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植 体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。 2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继 代培养，挑选生长快速的细胞。 3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择 分散性好、生长速度快的细胞。 4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的 细胞株。 5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定 性。 6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。 细胞株定向富集驯化 1.激素自养型细胞株的筛选驯化： 将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。 2.耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化 人工诱变筛选 1.悬浮培养系统 细胞融合、细胞重组、基因工程等方法对细胞株进行改良。 2.愈伤组织系统 3.原生质体系统 （二）次级代谢产物生物合成 莽草酸途径： 喹啉类、异喹啉类、吡咯啶类、乌头类、吲哚类、大环类生物碱等。 聚酮途径：聚酮 类化合物。 甲瓦龙酸途径： 萜类、甾体。 （三）影响次级代谢产物的因素 1.生物因素 （1）细胞株 稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。 在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。 缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。 （2）细胞凋亡 细胞凋亡（Cell apoptosis），也叫程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。 细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。 关键是要保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累，这可以通过采用合适的培养工艺来实现。 （3）细胞团 植物细胞容易聚集成团，每个细胞团一般由4-300个细胞组成，大小因植物细胞种类不同具有较大差异，例如：烟草细胞团直径大约在350-1000μm，长春花细胞团在40-2000μm之间。 细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。 适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。 （4）生物合成机制 次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及 多基因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因 素非常多。 结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。 2.化学因素 主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体和调节因子等。 （1）营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代 谢产物。 普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目的，对培养基进行优化，从而保证最大限度地积聚目标产物。 （2）前体（precursor ） 指某一代谢中间体的前一阶段的物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。 缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。 （3）诱导子 狭义诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关 的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。 广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次