斐林试剂和双缩脲试剂使用释疑.docVIP

斐林试剂与双缩脲试剂的使用释疑 王升友(江苏省赣榆县城头中学，222131) 中学生物教学，2003年第6期 在教学过程中，发现许多学生对于用斐林试剂鉴定可溶性还原糖与用双缩脲试剂鉴定蛋白质的实验中存在着许多疑难问题，为便于学生理解和掌握，现归纳总结如下： 1可溶性还原糖鉴定及蛋白质的鉴定原理不同 1 1可溶性还原糖鉴定原理 可溶性还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖等的分子内都含有游离的具有还原性半缩醛羟基，当与新配制的一定浓度的Ｃｕ(ＯＨ)2悬浊液混合后，在加热的条件下，将Ｃｕ(ＯＨ)2还原为砖红色的Ｃｕ2Ｏ沉淀，而还原性糖本身则被氧化为相应的有机酸。以葡萄糖为例的反应式如下： 1 2蛋白质的鉴定原理 在碱性溶液中，双缩脲能与Ｃｕ2+作用，形成紫色或紫红色的络合物。故双缩脲试剂可鉴定双缩脲的存在，而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键。因此，蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应。 2斐林试剂与双缩脲试剂的配制与使用不同 2 1斐林试剂的配制 甲液：质量浓度为0 1ｇ·ｍＬ-1的ＮａＯＨ溶液 乙液：质量浓度为0 05ｇ·ｍＬ-1的ＣｕＳＯ4溶液使用时临时配制，将4滴～5滴乙液滴入2ｍＬ甲液中，振荡混合均匀后即可使用。 2 2双缩脲试剂的配制 取10ｇＮａＯＨ放入量筒内加水至100ｍＬ，待充分溶解后倒入试剂瓶中配制成质量浓度为0.1ｇ·ｍＬ-1的ＮａＯＨ溶液，瓶口塞上胶塞，贴上标签，写上试剂Ａ。取1ｇＣｕＳＯ4放入量筒中，加水至100ｍＬ，待充分溶解后倒入试剂瓶中配制成质量浓度为0.01ｇ·ｍＬ-1的ＣｕＳＯ4溶液，瓶口塞上胶塞，贴上标签，写上试剂Ｂ。使用时，先向试管中加入2ｍＬ试剂Ａ，摇荡均匀，再向试管中加入3滴～4滴试剂Ｂ，摇荡均匀即可。 3反应过程中，出现的颜色变化及原因不同 3 1用斐林试剂鉴定还原糖的实验 因先加入刚配制的Ｃｕ(ＯＨ)2，故溶液变成浅蓝色;加热后，部分Ｃｕ(ＯＨ)2被还原为砖红色的Ｃｕ2Ｏ，因二者混合故呈现棕色;随着反应的继续进行，Ｃｕ(ＯＨ)2被全部还原为Ｃｕ2Ｏ，故而出现砖红色的沉淀。颜色变化为：浅蓝色→棕色→砖红色(沉淀)。 3 2用双缩脲试剂鉴定蛋白质的实验 加入双缩脲试剂Ａ，溶液为无色;加入双缩脲试剂Ｂ，因有Ｃｕ(ＯＨ)2生成，故呈现浅蓝色;振荡均匀后，由于反应的进行，出现紫色的络合物。颜色变化为：无色→浅蓝色→紫色。 4实验过程中，应熟练掌握的问题 4 1斐林试剂为何要现配现用?因斐林试剂很不稳定，容易生成蓝色Ｃｕ(ＯＨ)2沉淀，所以应将甲液、乙液分别配制储存，使用时再临时配制。 4.2用斐林试剂鉴定时，为何不能先加入ＮａＯＨ，后加入ＣｕＳＯ4，而必须混合后再加入?因为若先加入ＮａＯＨ，还原性糖中的还原性半缩醛羟基易被氧化而失去还原性，再加入ＣｕＳＯ4后不能产生Ｃｕ2Ｏ沉淀，只有将其先配成Ｃｕ(ＯＨ)2悬浊液，才可产生砖红色沉淀。 4 3在做该实验时，为何一般不选用双子叶植物的叶子和单子植物(如韭菜、鸢尾)的叶片?在双子叶植物中，光合作用的主要产物葡萄糖形成后合成为淀粉，暂时储存在叶子内，因此最好不用双子叶植物的叶片作实验材料;在单子叶植物如韭菜、鸢尾，并不将光合作用的初始产物转变为淀粉，因此叶内含有大量的可溶性还原糖，但是，由于叶片中叶绿素的颜色较深，对于鉴定时的颜色反应起着掩盖作用，导致实验现象不明显，因此也不选用单子叶植物的叶子。 5应注意的问题 5 1在使用双缩脲试剂时，为什么要先加入试剂Ａ，后加入试剂Ｂ?先加入试剂Ａ，造成碱性环境，而只有在碱性环境中，蛋白质才容易与Ｃｕ2+发生颜色反应。 5 2若加入试剂Ａ后，为什么只能加入3滴～4滴双缩脲试剂Ｂ，而不能加入过量?因为若加入过量的双缩脲试剂Ｂ，ＣｕＳＯ4在碱性溶液中生成大量的蓝色Ｃｕ(ＯＨ)2沉淀，会遮蔽实验中所产生的紫色，影响观察结果。