炭疽实验室检测技术.pptVIP

谢谢大家！ 也感谢中国疾控中心传染病所魏建春博士等多位老师一直以来所给予的帮助和指导！ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 减毒疫苗株多为cap + / tox -或cap - / tox + ,大部分Pasteur 株为pX01 - / pX02 + (少数两种质粒都有)，Sterne 株为pX01 + / pX02 - 。 自然界中也发现了pX01 + / pX02 - 突变株,尚未发现pX01 - / pX02 + 突变株。 因此，以质粒基因为模板设计引物时，一定要设计两对以上针对不同质粒基因的引物才能保证不漏检。 也有研究发现土壤中可能存在至少一种与CapB 和CapC 基因同源的细菌基因。因此，用CapB 和CapC 基因为靶序列的PCR 检测环境样品阳性时的评价要谨慎。 染色体上的一些基因和DNA 片段，如rpoB 基 因、Sap 基因、vrrA 基因、SG2850 片段和Ba813 DNA片断,均有用于引物设计的报道。 rpoB 基因编码RNA 聚合酶β亚单位，在细菌进化中该基因比较保守，在细菌染色体中至少有一个拷贝，该基因在细菌代谢中起着重要作用。 Qi 等比较了不同炭疽芽孢杆菌和其它芽孢杆菌的rpoB 基因，设计了炭疽芽孢杆菌的特异引物，实验结果表明，该引物只与一种非炭疽芽孢杆菌(芽孢杆菌Ba813211 株) 交叉，是目前为止染色体基因中炭疽芽孢杆菌特异性强最强的一对引物。 PCR检测样品处理 标本处理： 煮沸法：取少量标本加入适量缓冲液或纯水中，100℃煮沸10-20分钟，取上清液做模板进行PCR反应。如为纯菌，则加热后需用0.22μm滤器过滤后使用。 DNA提取：炭疽PCR检测主要是检测毒力相关基因，这些基因主要存在于质粒上，因此可只提取质粒DNA，一般使用市售试剂盒提取，方便、快速。 PCR检测引物序列 pagA F: 5 ATT TGC GGT AAC ACT TCA CT 3 pagA R: 5 AGA CCG TGA CAA TGA TGG AA 3 cap外F：5 CCT GGT TGT TCT TTT CGT TGC 3 cap外R：5 CGG ATT GTA TAT GGA GTG GG 3 cap内F：5 TTT CAC CAG CAC CCA CAT AG 3 cap内R：5 GGG ACA GGA ATG TTT GGA TC 3 rpoB 2F：5 CCA ACA GTA GAA ATG CC 3 rpoB 2R：5 AAT TTC ACC AGT TTC TGG ATC T 3 PCR反应体系 10×反应缓冲液 2.5 μl 4×dNTP混合物（每种2.5mM）2μl 引物（上游10μm） 1μl 引物（下游10μm ） 1μl 待测模板 1μl Taq DNA 聚合酶 1ｕ 无菌去离子水 补足25μl 反应条件： 预变性95℃ 5min；95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸 5min。 pagA扩增结果，片段长度为923bp rpoB2扩增结果，片段长度为197bp cap外扩增结果，片段长度为1242bp cap内扩增结果，片段长度为1002bp 带内部对照的炭疽PCR检测技术 PCR方法对于致病微生物的检测有着重要的作用，但也有它的不足之处，由于交叉污染或者非特异性扩增，以及反应抑制剂等多种原因，常会出现假阳性或假阴性的结果。 使用内部对照可以有效的避免假阴性，但作为内部对照的模板，其浓度对于结果也有一定的影响。只有选取适宜的浓度，才能真正避免假阴性的发生。 内部对照的构建方法 PCR扩增获得炭疽芽胞杆菌的特异基因片段，克隆入质粒载体，通过限制性内切酶切掉特异基因片段的一段，再用连接酶连接起来，使同样引物扩增出的片段缩短。这样得到的质粒就可以作为内部对照的模板。 反应体系 反应体系 10×反应缓冲液 2.5μl 4×dNTP混合物（每种2.5mM） 2μl 引物（上游10μm） 0.5μl 引物（下游10μm ） 0.5μl 内部对照模板 0.5μl