人造海水配方.doc

人造海水的配方* （引自Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996） 名称 质量（×10-3kg） 氯化钠 氯化镁 硫酸钠 氯化钙 氯化钾 重碳酸钠 溴化钾 硼酸 氯化锶 氟化钠 23.98 5.029 4.01 1.14 0.699 0.172 0.100 0.0254 0.0143 0.0029 *：水＆化合物的总重量为1kg. 《海洋微生物及其代谢产物》??-林永成主编??2003?? 细菌的分离： 牛肉膏蛋白胨琼脂、营养琼脂等是分离细菌的常用培养基，前苏联细菌学家设计的ZOBELL 2216E培养基是培养好气性异养细菌较好的培养基，可培养多种细菌，SIMIDU培养基也常用于海洋好气性异养细菌的分离，PFENNIGS培养基适用于海洋光合细菌的分离，分离海洋弧菌可采用TCBS培养基，培养基PH一般为7.2-7.6,盐度为28到30,培养温度28到37， 培养时间1到7天，注意观察平板菌落变化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小菌落，为防止真菌的污染，常在培养基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等。放线菌因生长缓慢且菌落不大，一般不会对细菌的分离产生影响。 放线菌的分离： 1 放线菌是数量最多、最常分离到的G+，JENSEN的研究表明，离海岸越近，在0到1米水深的底泥样本中，链霉菌占分离的放线菌总数的86%，小单孢菌占12%，其他占2%。 2 分离培养基 多采用合成培养基（高氏合成一号、精氨酸、天门冬素培养基）和有机培养基（HV、YE、WAKSMAN、bennett）,高氏合成一号是分离的常用培养基，适合尤其是链霉菌的生长，但细菌和真菌也大量生长。HV是以腐植酸为唯一碳、氮源的培养基，对小单孢菌、小双孢菌、指孢囊菌、链孢囊菌的选择性高，但是生长的放线菌形态不完整，难以观察，给挑菌工作带来困难。 抑制剂 放线菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、链霉素可抑制细菌，重铬酸钾对真菌和细菌均可抑制，0·005%-0·01%是较理想的分离抑制剂，有三个特点：抑制细菌和真菌的生长，不影响放线菌的正常生长，还可促进一些放线菌孢子的萌发，价格低廉。 样品预处理 120干热处理样品1小时能大大减少细菌和链霉菌的数量，而对稀有放线菌影响较少，甚至能利于孢子萌发，由于海洋样品多潮湿，同时孢子对湿热敏感，故采用50到55度的热处理会促使大部分孢子萌发。 化学杀菌剂法 杀菌剂 苯酚 SDS 葡萄糖酸洗必泰CG 苄索氯氨BC 碳酸钙 氯化钙 富集的放线菌 非链霉菌属 小单孢菌 智囊孢菌 小双孢菌 非链霉菌属 小四孢菌 所有放线菌 放线双孢菌 小四孢菌 链孢囊菌 差速离心 浓缩 真菌的分离： 到2000年止已认知的海洋真菌仅仅444种，包括177属360种的子囊菌（占81·1%），51属74种半知菌（占16·7%）和7属10种的担子菌（占2·2%） 选择性富集 海水样品可通过浓缩或过滤，用无菌的0·45μm孔径的硝酸纤维素滤膜过滤海水，然后直接把滤膜放在培养基上培养。 分离酵母菌时，可将含50-200㎎／Ｌ氯霉素的分离培养基用浓盐酸调PH值至3·4酸性条件下可抑制很多细菌生长。 植物内生真菌分离方法： 进行分离前，对植物材料表面进行彻底消毒非常必要，典型的消毒剂有70%-90%的乙醇、漂白剂、1%的过氧乙酸和3%-30%的过氧化氢，多采用PDA培养基，并加入庆大霉素、氯霉素、链霉素等抗生素，抑制细菌和放线菌的生长。 鉴定： 16S rRNA相对分子量适中，易于进行序列测定和分析比较，可以为细菌鉴定提供相对稳定可靠的信息，广泛用于评价生物遗传多态性和系统发生关系。18S rRNA成为目前研究真菌属物种多样性的分析比较。原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，真核微生物转录区包含5S、18S、5·8S、28S。 （C+G）mol％在种内不超过4%,属内不超过10%。低于2%没有分内学意义。只具有否定价值，需与表型特征相结合。 16S rDNA成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，适用种及种以上的分类单位。 同源性≥95%的菌可归为同一属，≥97%可视为同一种，大于97%时必须测定DNA-DNA杂交率是否大于70%才能确定是否为新种。由于对同种内的不同菌株分辨力较差，更适合研究属及属以上的菌株。 18S rDNA普遍用于真菌物种的鉴