pBLUE-T 载体连接试剂盒使用说明书.pdfVIP

◆ pBLUE -T 载体连接试剂盒 ◆ 目录号 1704 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 pBLUE- T 载体连接试剂盒 目录号：1704  试剂盒组成、储存、稳定性： 20 次 60 次 20 次 60 次 组成 ( 170401) ( 170402) ( 170403) ( 170404) pBLUE-T vector （30ng/l） 20 l 60l 20 l 60l 1000bp Control （30ng/l ） 5l 5l 5l 5l 10 PEG Enhancer 50l 150l 50l 150l 2 Quick Ligation Buffer 100l 300l 10 x Ligation Buffer 40l 120l T4 DNA ligase, 5U/l 100U 300U 储存：－20℃保存，载体反复冻融至少10 次不影响使用质量。  产品介绍： 许多高温DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’ 末端后都带有一个突出的碱基A ，这样的PCR产物可以用3’末端后带有一个突出碱基T 的载体方便地进行克隆。pBLUE-T 载体来源于pBlueScript II SK(+) 质粒，在EcoRI酶 切位点处添加了适当序列，经XCM I 酶切后其3 ’末端直接产生未配对的T碱基而成， 因此有更高的重组效率。pBLUE-T 载体插入位点两端独特设计的两个ECOR I位点使插 入片段可以用廉价高效的ECOR I单酶切检测； 同时pBLUE-T 载体不含NdeI或NcoI 限 制性内切酶位点，可方便用于克隆含上述酶切位点的基因。此外，本公司载体连接体 系还有背景低（蓝斑小于10%），重组率高（白斑中超过90%有插入片段），可快速连 接等特点。本说明书末列出了pBLUE-T 载体相关的技术资料，其全序列可参照 pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位点处序列稍有不同。 - 1 -  操作步骤： 1. 连接反应的准备： PCR产物是否要进行纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物非常干净，不经纯 化就可直接进行连接反应。但如果是以质粒为模板的PCR产物则必须进行纯化，模 板质粒有可能也形成白斑。PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。本公司生产的 DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp 以上的DNA片段能很好地进行回收。 Taq、Tth、AmpliTaq 、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其末端都带有一个突 出的3’ A 。Taq酶和Pfu 、Pwo 、Tli或Deep vent 等具有35 ’外切酶活性的DNA 聚合酶混合扩增的产物末端可能带有3’ A 。具有3’ A末端的PCR产物可以直接用 pBLUE-T Easy 载体进行克隆连接。具有3’5 ’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的 PCR产物是平末端，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先进行3’端加A工作。 2. 常规连接反应： 1) 在一个标准的10 l 连接反应体系中，加入1 l 30ng pBLUE-T 载体、X l PCR 产物(在通常状况下，没有必要对PCR 产物进行精确定量，一般PCR 产物与载体 的摩尔比优化至2:1~10:1 就可以得到良好结果，推荐3:1)、1l 10 ligation Buf