联苯利用节杆菌YC-RL1 中2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶BphC 功能验证.PDF

微生物学通报 Jul. 20, 2017, 44(7): 1639−1648 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170126 研究报告 联苯利用节杆菌 YC-RL1 中2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶 BphC 功能验证 * 乔铖 任磊 樊双虎 贾阳 赵百锁 闫艳春 ( 100081) 摘 要：【目的】通过节杆菌(Arthrobacter sp.) YC-RL1 对多氯联苯降解过程中关键基因 bphC 的克隆与原核表达，鉴定其编码的2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶BphC 的酶活特性与功能。【方 法】以菌株YC-RL1 全基因组为模板进行PCR 扩增获得bphC 基因，将该基因转入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞后进行原核表达；利用镍柱亲和层析法对 BphC 酶进行纯化并分别 测定该酶在不同条件下对底物2,3-DHBP 的催化特性，确定其最适反应pH 、温度及不同金属离 子对酶活特性的影响；进一步根据米氏方程对该酶的动力学参数进行测定与分析。【结果】通 过PCR 扩增获得了bphC 基因，其大小为930 bp；对该基因进行原核表达，所得重组蛋白BphC 携带有 6 个组氨酸标签，经纯化后体外仍具有活性，该酶作用于2,3-DHBP 时的最适pH 与温 度分别为pH 7.4 和30 °C ，且在最适条件下，Fe2+ 、Cu2+及Cd2+等金属离子可明显促进其酶活作 用，但多数金属离子对该酶有不同程度的抑制作用；该酶在与底物2,3-DHBP 作用过程中，酶促 –1 动力学常数分别为K ：8.67 mmol/L，V ：27.32 μmol/s ，k ：15.55 s ，k /K ：1.79 L/(mmol·s)， m max cat cat m 其催化效率同有关报道中同类酶的动力学特性比较均有所提高。【结论】菌株YC-RL 中的bphC 基因对于多氯联苯的生物降解具有至关重要的作用，其编码的BphC 是重要的芳香环裂解酶， 该酶对其底物具有较高的亲和性，可在体外环境中发挥高效的酶促作用，具有良好的应用价值。 关键词：多氯联苯，生物降解，2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶，酶促动力学 Characterization of 2,3-dihydroxybiphenyl-1,2-dioxygenase BphC from biphenyl degrader Arthrobacter sp. YC-RL1 * QIAO Cheng REN Lei FAN Shuang-Hu JIA Yang ZHAO Bai-Suo YAN Yan-Chun (Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract: [Objective] This study focused on gene clo