NPTⅡ活性检测.PPT

* Western杂交 是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上，然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特异抗体相结合的原理而进行的。 蛋白质区带-----抗体（同位素标记） 蛋白质水平 * 4、生物学鉴定及代谢测定 表型鉴定 稳定性鉴定 最终鉴定 抗病 抗虫 抗除草剂 花色改变 品质改良 * 甜菜碱醛脱氢酶 （AhBADH）转枳及其抗盐性研究 * AhBADH基因转枳及植株再生 30 days 60 days 90 days 120 days * 转基因植株分子鉴定 * 转基因株系GB含量 * 200 mM NaCl处理 The transgenic plants were more tolerant to salt stress than the WT * Na+、Cl-、K+ 含量 WT #48 #51 #133 * Na+、Cl-、K+ 含量 The transgenic plants accumulate lower levels of Na+ and Cl-, but they had higher K+ under salt conditions. * 第五节 遗传转化问题及新技术 * 1、转基因整合 转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制过程整合到核基因组中。 转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的，外源DNA可以插入任何一条染色体，也可以插入一条染色体上的任何位点，但对转录活跃区具有优先插入特性。 染色体的选择、染色体上的整合位点、一个基因组中发生的整合事件次数、一条染色体上发生的整合事件次数、一个整合位点的拷贝数 规律性：外源DNA的整合较多发生在DNA同源序列区、植物DNA的高度重复序列区。 * 转基因整合的遗传效应 位置效应(position effect)： 重组效应(recombination effect) 转基因沉默(transgene silencing) 表达多样性(diverse expression)。 * 外源基因在转基因植物中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默。 1986年Peerbotte报道转基烟草中转基因发生沉默 2、转基因沉默（transgene silencing) * 转录水平的基因沉默(TGS)：指对转基因专一的细胞核RNA合成的失活，转基因无法被顺利地转录成相应的RNA而导致沉默，多发生于转录的起始和终止, 一般只有外源基因发生沉默 转录后水平的基因沉默(PTGS)转基因在细胞核里能稳定转录，但在细胞质里没有相应的稳定的mRNA存在的现象 转基因沉默主要发生在 * 转录水平的基因沉默 转基因及其启动子甲基化 多拷贝重复序列 同源基因间的反式失活 位置效应引起 后成修饰作用 * 转录后水平的基因沉默 RNA干扰技术 * （细胞膜） （细胞核） （细胞质） 基因的表达 转录 翻译 （转运RNA） （核糖体RNA） * 基因沉默，即性状不表现 外源导入或者转基因表达反义RNA，抑制rRNA和tRNA的翻译。 * RNAi RNA 干扰(RNA interference，RNAi) ：外源或内源性的双链RNA(dsRNA)介导的特异性地与其同源的mRNA 结合并导致其降解，从而抑制基因的表达，致使内源基因沉默的现象。 * RNAi的基本原理 RNAi是一个依赖ATP的过程，在此过程中，dsRNA(外源或内生)首先被降解为具3’端有2～3nt突出、长21～23bp 的小分子双链RNA，这种RNA称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA，并介导其降解。 在RNAi过程中一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA酶切转化为siRNA，siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解，从而导致特定基因沉默。 * 在RISC中，起靶序列识别作用的是siRNA的反义链，在ATP存在时，依赖于ATP的解旋酶解开siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换，mRNA取代正义链与反义链互补，然后由活化的RISC在互补区的中间，距离siRNA反义链3’末端约12bp处切断靶mRNA序列。 * RNAi的分子机制 Dicer dsRNA siRNA ATP 蛋白复合物 RISC 正义链 ATP 靶mRNA * 3、无选择标记转化 可消除选择标记基因对转基因作物安全性方面的影响 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠加所带来的困难 * marker-free转基因植株 共转化法＊(基因枪与农杆菌