模块三基本操作试验技术的训练.DOC

实验六 纸色谱 一、实验目的 学习和掌握纸色谱法分离有机化合物的基本原理和实验技术。 二、基本原理 纸色谱是一种以滤纸为支持物的色谱方法，主要用于多官能团或高极性的亲水化合物如醇类、羟基酸、氨基酸、糖类和黄酮类等的分离。它具有微量、快速、高效和灵敏度高等特点。 纸色谱的原理比较复杂，涉及分配、吸附和离子交换等机理，但分配机理起主要作用，因此，一般认为纸色谱属于分配色谱。 滤纸几乎是由纯粹纤维素构成的，在水蒸汽饱和的空气中，它可以吸附20～25 %的水分，其中约有6～7 %的吸附水是通过氢键与纤维素的羟基结合的，吸附极为牢固，一般条件下，很难脱去。这些吸附水就构成了色谱过程的固定相，展开剂为流动相，滤纸只起到支持固定相的作用。作为分配色谱，其分离过程是依赖于萃取原理而实现的。当在滤纸上点样后，样品实际上是溶解在固定相 (吸附水)中的，当流动相与溶解有样品的吸附水接触时，样品便在固定相和流动相中按照分配系数 (K)的大小进行分配，这实际上是流动相对固定相中的物质进行萃取。由于流动相是连续不断地向前移动，所以这种萃取过程也就是连续不断地进行，最终导致物质随着流动相的移动而移动。由于各种物质的分配系数不同，所以，物质的移动速度也就不同。与展开剂的移动速度相比，分配系数较大 (即在固定相中溶剂度大)的组分，移动得慢一些，而分配系数较小的组分，移动得快一些。这样，不同的物质便得到了分离。 三、滤纸的要求与选择 对普通实验来说，一般实验室中的滤纸都可以用。但在作某些定量测定或某些深入研究的工作中，对滤纸就要作适当的选择了。一般地说，色谱用滤纸要求质地细密，厚薄均匀，平整，对光检测时透光度均匀，不得有污点，应有一定的强度，滤纸对溶剂的渗透速度适当，滤纸中应不含有水或有机溶剂可溶的杂质，对氨基酸分析有干扰的铜、铁元素的含量分别在1.5和10 ppm以下。 实验室常用的国产色谱滤纸有杭州新华造纸厂生产的定性滤纸、定量滤纸和层析滤纸，以新华 1号滤纸最为普遍。如果需要加大点样量，可选择较厚的新华3号滤纸。使用进口滤纸最多的当属英国造的沃特曼 (Whatman)l号滤纸。 将滤纸裁剪成条形时，应顺着纤维排列的方向。在裁剪滤纸时，要把周边裁剪整齐，不能留毛边。还要注意防止手垢和汗渍等杂质污染滤纸。 四、展开溶剂的选择与配制 纸色谱用的溶剂一般要求: (1) 纯度高。有时仅含1 %的杂质，也会相当大地改变被分离物质的Rf值。即便有微量的杂质存在，在溶剂移动和挥发过程中，也会形成杂质的浓集区域而影响检出。(2)有一定的化学稳定性。若在展开过程中容易被氧化的溶剂不宜作为展开剂。(3)容易从滤纸上除去。 纸色谱中，很少用单一溶剂作为展开剂，多用极性的混合溶剂，且其中之一是水。在选择展开剂时，一般按照相似相溶原理进行。如果被分离物质是易溶于水，但难溶于乙醇的的强亲水性的，如氨基酸、糖类等，可选用含水量在 10～40 %之间的高含水量系统作为展开剂。若物质是可溶于乙醇和水，且较易溶于乙醇的中等亲水性的，则宜采用中等含水量的溶剂系统作展开剂。对于难溶于水，但易溶于亲脂性溶剂的物质，则展开剂主要组分是苯、环己烷、四氯化碳、甲苯等。对于完全亲脂性物质如甾醇等，最好采用反相系统，即用甲酚胺、二甲基甲酰胺等浸渍滤纸作固定相，可用含水的醇或与此相近的溶剂作为流动相。 溶剂系统的组成与含水量的变化规律是: 有机溶剂的极性越大，所配成的混合溶剂的有机相中含水量越高，反之，含水量越低。在有机溶剂的同系物中，分子量越大，所配成的混合溶剂有机相中水分含量越低。据此，可以根据需要选择合适的有机溶剂，配制一定含水量的溶剂系统，以获得较理想的Rf值。 对于酸性或碱性物质来说，由于其电离平衡现象的存在，展开时必将产生拖尾现象。因此，通常在溶剂中加入较强的酸 (如甲酸)或碱 (如氨)来抑制弱酸或弱碱的电离。另一种常用方法就是在滤纸上喷上缓冲盐类，以保持一定的pH值，干后再展开。但必须注意，展开剂也必须事先用缓冲液平衡后再使用。 溶剂的一般配制方法是将溶剂各组分按配方比例充分混合即可。如果混合液分层，则必须在充分振荡混合、静置分层之后，分出有机相作为展开剂。 常见的纸色谱斑点拖尾现象有以下几种情况: ①点样量过多，样品量超过了点样处滤纸所荷载的溶剂能够溶解的能力。 ②某些物质可以形成多个电离形式，且各自有其不同的Rf值，因而在纸上造成连续拖曳，这种情况可使用碱性或酸性的展开系统，抑制其电离即可消除。 ③被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等杂质形成络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。 ④某些物质在展开过程中会逐渐分解，如肾上腺素和某些含硫氨基酸等，可将它们转变成稳