GV3101农杆菌电转感受态细胞.PDFVIP

GV3101 农杆菌电转感受态细胞 目录号：BC308 储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。 组成 BC308-01 GV3101Electrocompetent cells 20×50μl pCAMBIA2301(1μg/μl) 1支 R R R 基因型：C58(rif ) TipMP90(pTiC58DT-DNA) (Str /Gent ),Nopalinetype 产品介绍： GV3101菌株为农杆菌C58型背景，核基因中含有利福平抗性基因rif。此菌株还携带一种自身转运功能丧 失的质粒 （disarmedTiplasmid）。GV3101菌株含有pMP90(pTiC58DT-DNA)，该质粒含有vir基因 （vir基因是 TDNA插入植物基因组所必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可辅助 植物双元表达载体的T-DNA的转移）。pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒还含有Str和Gent抗性基因，赋予GV3101 菌株链霉素和庆大霉素抗性。GV3101农杆菌适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。GV3101 5 电转感受态特别适用于大质粒的转化，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率大于10 cfu/μgDNA。 操作方法： 1. 电极间距为0.1cm的电转杯 （GenePulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰 面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。 （电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗 干净去掉菌液和DNA，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净 台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用） 2. 取-70℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1μg质粒DNA （洗脱或溶解质粒的溶液中 离子不能太高，或用双蒸水稀释），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将感 受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。 3. 启动电转仪，设置电击参数：C 25μF，PC 200ohm，V 2400V （此参数为BioRad公司推荐，依据不同 电转仪设置针对农杆菌合适的电击参数）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯快速放入电转槽 中进行电击步骤。电击完成后，将电转杯快速插入冰中，加入700μl 无抗生素的LB 并转移到原来保留 的感受态空管中，28℃，150-200rpm振荡培养2-3小时。 4.6000rpm离心一分钟收菌，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取100μl的菌液涂布于含相应抗生素 的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50 μg/mlkan 时，28℃培养48h即可； 平板中同时加入50 μg/mlkan，20μg/mlrif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50 μg/mlrif则需要 28℃培养72-90h）。 注意事项： 1. 1/10 混入质粒时应轻柔操作，加入质粒的体积不应大于感受态体积的 ，质粒不纯或超大质粒会导致转化 效率急剧下降。 2. 平板上菌落过多时，菌落很小。为了获得大的菌落，应减少质粒用量或减少涂布量，或将菌落转移到 新平板上生长。 3. 利福平使用的工作浓度浓度不应高于25μg/ml，过高的利福平浓度会降低生长速度和转化效率。 4. Ti 利福平具有防止止杂菌生长筛选农杆菌的作用；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 质 粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时可不考虑添加链霉素或庆大霉素， Ti 质粒丢失的概率极低 可忽略 。( )