第4课沉淀法.ppt

第4章 沉淀法 知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。 1. 沉淀法概述 沉淀定义 沉淀特点 应用范围 沉淀分类 沉淀法分类 盐析法 有机溶剂沉淀法 选择性变性沉淀法 等电点沉淀法 离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 高价金属离子沉淀法 蛋白质的理化性质的回顾 活性蛋白 非活性蛋白 理化性质 溶解度 提取方法 2. 盐析沉淀 盐析沉淀步骤 加沉淀剂方式 陈化条件 脱盐处理 盐析机理示意图 盐析的机理 ①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降； ②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降； ③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。 盐析沉淀基础 Cohn方程式logS=β-KsI Ks盐析 β盐析 二次盐析 图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图 不同蛋白质的溶解度曲线 蛋白质的盐析分布曲线 溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b) 盐析影响因素 对β影响 对Ks影响 盐种类 盐浓度 温度 pH值 无机盐种类的影响 温度的影响 pH对β的影响 蛋白质起始浓度的影响 二次盐析 盐析操作 3 等电点沉淀实例 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。 4 有机溶剂沉淀原理图 有机溶剂沉淀实例 5 选择性热变性沉淀实例 酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液，37℃水浴保温2 h，室温搅拌3 h，离心收集上清液，升温至55℃，保温20 min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。 6 其他沉淀法 （1）非离子型聚合物沉淀法 （2）聚电解质沉淀法 （3）金属离子沉淀法 （4）亲和沉淀 7 凝聚和絮凝技术 凝聚技术 絮凝技术 第五章 沉淀法课后练习 名词解释： 盐析法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法，等电点沉淀法，盐溶，盐析，β盐析，Ks盐析，二次盐析 盐析的机理 有机溶剂沉淀的机理 二次盐析如何实现？ * * 图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）(○)NaCl; (▼)KCl; (?)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠