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激光荧光漂白恢复术（FPR） 一、测量基本原理 二、激光荧光漂白恢复装置 三、生物学应用 显示荧光恢复曲线的方法之一是采用“荧光恢复系数”，定义为 式中 为漂白后在时刻t的荧光， 为初始荧光， 为观察很长时间后的荧光恢复的强度。 二、激光荧光漂白恢复装置图 激光荧光漂白恢复装置主要有三个部分：显微光学系统、光电检测系统和微型计算机及外围系统。（如图2 ） 由于利用微区漂白测定膜流动，难以知道流动方向，而采用荧光图形漂白法可以测定膜表面分子的扩散运动方向。经扩束后的平行激光束照射于掩膜上，掩膜上的图象经过物镜成像于样品上。因此样品上的激光受照区不再是一个微区光斑，而是一个缩小的掩膜的荧光图象，该图象的运动方向易于被鉴测。 三、生物学应用 FPR为生物膜的研究提供了一种有利的工具，同时也为其它有关应用提供了广阔的的潜在可能性。此种方法被用于测定脂类、疏水肽、膜蛋白或亲脂性蛋白在双层膜或膜中的侧向扩散。 * * 一、测量基本原理 激光荧光漂白恢复术是用一束强激光照射细胞膜微区（小于10μm2），该微区先被荧光染料所标记（浸在燃料中），在强激光的照射下，该微区已标记的荧光分子产生了不可逆的光化学漂白。此后，改为用弱激光（衰减103~104倍）照射监测该漂白区域中荧光恢复动力学过程，因为该微区的荧光分子已被不可逆漂白，那么再出现的荧光，则是由该微区之外的细胞膜的其它区域运输过来，称为输运过程。最后，由此动力学过程获得荧光漂白恢复动力学曲线，并计算扩散系数或流动速率。 输运过程有三种情况，对应三种曲线。典型的 理论曲线如图1所示。 对于不同的输运过程（扩散、流动、二者混合）分别给出了低漂白限时的。扩散恢复是一个斜率逐步递减的单调曲线，它是该微区内外漂白标记分子相互扩散的过程；流动曲线呈S形，则是标记分子穿越微区做一维定向流动。 1 2 3 0.10 0.05 0 流动 扩散+流动 扩散 图1 The principle of FPR 光电倍 增 管 放大器 接口 计算机 打印机 氩离子激光器 电源 滤光片 电磁铁 斩光片 功率计 斩光片 目镜 干涉滤光片 样品 图2 在显微光学系统中，激光束兼作漂白和测量光源，因此激光器的稳定性极为重要。（装置图见上页）图中氩离子激光器输出的488nm激光束，通过分束器分离成漂白光束和监测光束，经匹配透镜进入荧光显微镜，由物镜聚焦于样品上。样品的微弱荧光信号通过物镜、二向色镜等到达光电倍增管以及此后的计算机处理电路。为了提高光电倍增管的输出和信噪比，加入一个截止频率为4Hz、截止特性达26db的低通滤波器，可有效地降低信号的噪声水平。此装置的激光功率稳定度优于1%，漂白时光强增强一千倍。通过斩光器斩光，可使得测荧光时减少照射时间。 掩膜 物镜 样品 图3 荧光图形漂白原理图 *