一种改进的快速PCR定点突变技术.pdfVIP

生物技术通报 年第 期 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006 3 一种改进的快速PCR定点突变技术 高川 韩维涛 宋云扬 张靖 王惠芳 (北京防化研究院第四研究室,北京 ) 102205 摘 要: 在基因工程与蛋白质工程研究中常常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控、蛋白质的结构 与功能。本项研究在快速PCR定点突变技术的基础上,改进实验方法,简化实验步骤,以适用蛋白质结构改造研究的需 要。建立的突变技术仅需一次 反应即可完成基因的定点突变,突变效率为 %左右。该法对 个连续碱基的突 PCR 79.6 1～3 变和对间隔 个甚至多达 个碱基的数个密码子突变效果都很好。 4 15 关键词: PCR反应 突变引物 基因 定点突变 ATechniqueofImprovedRapidSite-directedMutagenesis GaoChuan HanWeitao SongYunyang ZhangJiang WangHuifang (Thefourthdepartmentofresearchinstituteofdefencechemistry,Beijing102205) Abstract:Mutantspreparedbymutagenesismethodsareusuallyusedtostudygeneregulations,geneexpressions andthestructure-functionrelationshipsofproteinsingeneengineeringandproteinengineering.Inthisstudy,wefocus onestablishinganew genemutationtechnique,improvingtheexperimentalconditionsandexpandingthepractical extentsformeetingthedemandsofengineeredproteinstructures.Thetargetgeneswereinsertedintothecloning —plasmids.ThemutationwascompletedonlybyonestepPCR reactionusingadouble-strandedDNAtemplate vectors anddouble-mutationprimerscatalyzedbyTaqplusDNA polymerase.AftertheDNA templatewasdigestedbya restrictionendonuclease,thevectorswereintroducedintohostcellsandthetargetgeneswithmutationswereexpressed ’ byusinghostcellstranscriptionandtranslationmechanism.Themutationratewas79.6%.Thismethodwaseffectivefor themutationof1~3continuousbasesandofafewcodonsspacedbyseveralbases. Keywords:PCRreaction MutationprimerGene Site-directedmutagenesis 基因工程与蛋白质工程研究中