口蹄疫多肽疫苗.pdf

第44卷 第6期 复 旦 学报 (自然科学版) Vb1．44No．6 2005年 12月 JournalofFudanUniversity(NaturalScience) Dec．2005 文童编号：0427—7104(2005)06—1037—05 抗 A5型 口蹄疫病毒重组多肽疫苗的研究 刘明秋 ，张 骏 ，陈维灶，严维耀 ，郑兆鑫 (复旦大学 生命科学学院遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室，上海 200433) 摘 要：根据 A型口蹄疫病毒(FMDv)的VP1基因序列及国际上公认的抗病毒中和表位，并结合对151蹄疫病毒 的研究成果 ，设计了A型FMDV的重组多肽疫苗．分别选择 VP1上21--40位和 137～160位氨基酸对应的基因 序列为表位基因，组成 137--160—21--40—137--160的串连结构，并以大肠杆菌 一半乳糖苷酶为大分子载体， 构建重组质粒 pLM99，在大肠杆菌中表达得到高含量的融和蛋白．体外免疫原性检测表明，所表达的融和蛋白 与标准A型阳性血清有特异性抗原 ／抗体反应，即说明该融和蛋白具有免疫反应性．免疫豚鼠的实验结果表明， 融合蛋白能在豚鼠体内诱导中和抗体，并使70％的豚鼠能抵抗病毒的攻击． 关键词 ：A型151蹄疫病毒；抗原表位；多肽疫苗 中图分类号：R329．7 文献标识码 ：A 口蹄疫(Foot—and—mouthdisease，F )是一种严重的传染病，被世界动物卫生组织列为烈性传染病A 类之首，其病原是口蹄疫病毒(FMDV)，可感染猪、牛、羊等30多种偶蹄动物 1【,2J．几个世纪以来，在全世 界范围内频繁地不问断地爆发和流行口蹄疫，造成了巨大的经济损失．口蹄疫病毒分为7个型，30多个亚 型，且各型之间变异大，不能交叉保护，所以对 口蹄疫的预防相当困难．目前主要有两种途径，第一种途径 是通过物理和化学手段对病毒进行灭活处理，对爆发流行地区进行隔离并对邻近地区染病牲畜及易感动 物进行扑杀．第二种途径是进行广泛的免疫接种． 免疫接种所用的疫苗可分为传统疫苗和基因工程疫苗．传统的弱毒活疫苗和灭活疫苗虽具有剂量小、 免疫效果好、保护时间较长、价格低等优点，但弱毒活疫苗也有减毒株不适用于流行株、毒力可能返强等弊 端；灭活疫苗同样具有灭活不彻底或强毒株逃逸，造成疫病流行等潜在危害3．因此，传统疫苗不够安全． 与传统疫苗相比，基因工程疫苗是一类非常安全的疫苗．基因工程疫苗种类很多，包括基因修饰活疫苗，生 物合成多肽疫苗，核酸疫苗等[4,5]．Bittle等[]和Pfaff等 ]率先根据FMDV氨基酸序列人工合成肽链，然 后连到较大的载体蛋白上，免疫兔、豚鼠、牛并获得成功．虽然人工合成肽能诱导实验动物产生中和抗体， 但不能诱导牛产生保护性应答．此后人们采用了多种手段来提高合成肽的免疫原性和免疫保护效力．目前 最常见的基因工程疫苗是生物合成多肽疫苗．我国自1983年便开始研究抗O型口蹄疫病毒的基因工程 疫苗．由复旦大学、上海农科院畜牧兽医研究所和浙江农科院病毒所等组成的协作组，对生物合成多肽疫 苗的研究已经取得很好进展 ~l． 本研究根据国际报道的A型毒株的序列及研究O型FMDV疫苗的成功经验，构建了抗A型FMDV 的基因工程疫苗． 1 材料和方法 1．1 材料 (1)菌株、质粒及主要试剂 大肠杆菌JM101，质粒 pWR590均由本室保存．限制性核苷酸内切酶 EcoRI、BamHI均为Roche公司产品．T4DNA连接酶、多聚核苷酸激酶均为Promega公司产品．PCR试 收稿 日期：2005—05—24 基金项目：教育部重大资助项 目(2001) 作者简介：刘明秋(1971～)，女，博士，讲师；通讯联系人郑兆鑫教授，E—mail：zxzheng@fudan．edu．cn 1038 复 旦 学 报(自然科学版) 第44卷 剂盒购 自上海复华生物工程公司．X—gal、IPTG均为Promega公司产品，蛋 白质 Marker为上海生工生物 工程技术服务有限公司产品．蛋白质2×上样缓冲液 (100mmol／LTris·C1(pH6．8)，200mmol／LD] ， 4％SDS，0．2％ 溴酚兰，