爪蟾卵非细.pdf

7一J 第 43卷 第4期 讲 学 童 爪蟾卵非细胞体系诱导小鼠肝细胞核凋亡 ．●———翌———±———一 生、————生———一．翟中和 … fI 惊 生命抖学学院晾㈣ ” 宁 摘要 通过向正常爪瞻卯提取物s150口加^dATP和细胞色素c，得到能有兢谆导外源；蟪r亡曲非蚓 胞体末．温育在上述非妇胞体系中的小鼠肝妇胞嚏表现出明显的凋亡特彳三井黟成太量的-悟_[小体 染色质 在桉膜下凝集形成直经相差较大并硝 互分葛曲球形区域，球形小悼通过棱膜匐外赛出，并逐渐与攘腰舟离． 最后 ，细拒棱几乎将所有DNA凝妻并排 出，五在桉膜边 缘残 留一当DNA成分．雨温育体系 中克满高度凝集 的调_[小体 ．这和凋_[ 体产生曲迁翟 以往工作未见描述．同时，小 鼠肝细胞蕴在卵提取物 中发生的形态变 化伴随着柴皂质 DNA被阵解成 DNA[adder 我 ：曲研究表 明，利 瓜鳍卵提取物研究细胞桉凋亡是一A 艮 4k 晖争，尻 ． 关键词 非洲爪赡 卵提取物S-150 细胞凋亡 凋亡小体 — _ ● ’ — ’ 。 。 ’ 一 ‘ ’ — ’ — —一 ● - ，- ●● - __ I 一 细胞编程性死亡，又称细胞凋亡，是细胞的一种基本生命现象，在多种生理和病理过程中 具有重要作用，它可保证有害细胞或多余细胞从多细胞生物体中被清除…．肿瘤转化和病毒 的致病可能就是绕过凋亡调控进行的 】．对凋亡过程的研究对于人们更好了解细胞生存的 调控机理是很有帮助的．然而在体 内研究细胞凋亡非常困难．主要表现在细胞同步性很低且 发生凋亡的时间很短 ．应用非细胞体系来研究凋亡可得到很高的同步性 ．I ：ebnik等人Ⅲ最 早创建了利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式，为人们建立非细胞凋亡体系进行了开创性 的工作．我们实验室结合以往非细胞体系核重建的经验，成功地建立了非细胞凋亡体系 在 爪蟾卵提取物中，被诱导凋亡的小 鼠肝细胞核在形态上表现出明显的凋亡特征，并可产生 DNA ladder． 1 材料与方法 卵粗提取物的制备按本实验室常用方法_4J．向卵粗提取物中加入蛋白酶抑制剂 a口r。tinin 与 leupeptinin至终浓度分别为 6与 8~g／mL，经 150000g(HITACHI55p一72型，转头 RPS 50—2，37500r／rain)离心2h后，收集可溶性胞质．我们称这种可溶性胞质为cytosolS-150． 小鼠肝间期细胞核的制备与纯化主要参考文献[5]．经 124000g超速离心纯化后的细 胞棱悬浮于核贮存缓冲液 (10reotol／LPipes，80mmol／LKC1，20mmol／LNaC1，250mmol／L sucrose，5mmol／LEGTA，0．5mmol／LSpermidine，02mmol／LSpermine．50％甘油)中 计 数后分装冻存于液氮 向上述制备的卵提取物 中加入 dATP与细胞色素 c至终浓度分别 为 1mmoI／L与 1~mol／L，每 50 L卵提取物中加入约 i00000小鼠肝细胞核，22*(2温育不同时间．取样进行 DAPI染色，荧光显微镜观察并照相． 上述温育一定时间后的样 品中加入 10倍体积 BufferD(100mmol／LTris—HC1，pH=80． 5mmol／LEDTA，02mol／LNaC1，04％SDS，0．2mg／mL蛋白酶K)，37℃温育过夜 等体 积酚一氯仿抽提 2倍乙醇沉淀．1％琼脂糖 电泳检测并观察、照相． 崭 学 屯 矗 2 实验结果 21 非洲爪蟾卵提取物可诱导小鼠肝细胞棱形态上出现明显的凋亡特征 我们使用的非细胞体系来 自于常规制备的用于诱导核重建的爪蟾卵提取物，向提取物中 加入 1mmol／LcLTP和 1 mol／L细胞色素c后，该体系即可用于体外诱导细胞核凋亡． 小鼠肝细胞核加八卵提取物后发生了剧烈 的形态变化 ：温育初期细胞核 中DNA呈弥散 均匀分布(图1(a))，约20rain后细胞核中的染色质开始出现不规则凝集(图1(b))并向核膜 边缘迁移(图3(b)