SA方法的建立.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１１）：７０～７３ 口蹄疫病毒非结构蛋白定量检测ＥＬＩＳＡ方法的建立 １ １ ２ １ １ １ 李永亮 　卢曾军 　杨苏珍 　田美娜 　谢宝霞 　刘在新 （１中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点实验室 国家口蹄疫参考实验室　兰州　７３００４６） （２河南省农业科学院动物免疫学重点实验室　郑州　４５０００２） 摘要　目的：利用口蹄疫病毒非结构蛋白３Ｂ单克隆抗体建立液相阻断ＥＬＩＳＡ检测方法，进行定 量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法：首先将工作浓度的３Ｂ单抗与待测病毒培 养液过夜结合反应，然后取结合液转移至用３Ｂ蛋白包被好的酶标板上，用标准３Ｂ蛋白做 １２个 梯度做对照，同时设阴性对照和空白对照。通过回归分析算出口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋 白３Ｂ含量。结果：回归曲线呈典型的Ｓ形，符合４参数ｌｏｇｉｔ曲线拟合，相关系数Ｒ＝０．９９，检测 范围为５～１５００ｎｇ／ｍｌ，半数抑制浓度（Ｉｃ５０）为１３０ｎｇ／ｍｌ。结论：该方法能特异、敏感的检测到病 毒培养液中的非结构蛋白３Ｂ成分，并进行定量。 关键词　口蹄疫病毒　单克隆抗体　非结构蛋白　定量ＥＬＩＳＡ 中图分类号　Ｑ５１１ 　　口蹄疫（ｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ，ＦＭＤ）被世界动物 控去除非结构蛋白成分的效果建立一个可供参考的检 卫生组织（ＯＩＥ）和联合国粮农组织（ＦＡＯ）列为Ａ类动 测方法。 ［１］ 物传染病之首 。大多数亚洲、非洲、南美洲国家一直 １　材料与方法 都通过注射灭活疫苗的办法来控制该病的流行，大多 数发展中国家和部分发达国家，如欧盟各国允许在暴 １．１　材　料 发 ［２］ ＦＭＤ时进行疫苗的紧急接种 。随之而来一个问 １．１．１　病毒培养液　用口蹄疫病毒接种ＢＨＫ细胞，接 ２１ 题就是要有效的区分 ＦＭＤ感染后康复健康带毒动物 ７ ８ 毒后２０～３０ｈ收毒，病毒滴度达到１０～１０ＴＣＩＤ／ｍｌ。 ５０ 和注苗动物。目前，一致认为检测多聚蛋白３ＡＢＣ或 １．１．２　单克隆抗体　口蹄疫病毒非结构蛋白３Ｂ单克 ３Ｂ抗体可较为准确地区分注苗动物与自然感染动 隆抗体由国家口蹄疫参考实验室制备、鉴定并冻存，相 ［３～６］ 物 。 对亲和力在１：１０００００以上。 　　灭活疫苗成分主要是口蹄疫病毒结构蛋白，也含 １．１．３　相关试剂　羊抗鼠酶标二抗（ＧａＭＩｇＧＨＲＰ）为 有微量的非结构蛋白。在免疫动物后动物主要产生抗 ｓｉｇｍａ公司产品，其它ＥＬＩＳＡ相关试剂由国家口蹄疫参 病毒结构蛋白的抗体，不产生或少量产生病毒非结构 考实验室提供。 ［７］ 蛋白的抗体 。免疫动物一旦产生抗非结构蛋白抗体 １