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附件1 DBS13前 言 本标准系首次发布。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由河北省卫生与计划生育委员会提出并归口。  食品安全地方标准 食品中诺如病毒检测 1 范围 RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中ＧⅠ型和ＧⅡ型诺如病毒的检测。 2 术语和定义 诺如病毒 norovirus 诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为26nm～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链RNA，组成长约7kb～7.5kb, 电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，诺如病毒是具有典型的羽状边缘、表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒共可分为Ｇ Ⅰ-Ｇ Ⅴ５个基因型, 其中感染人的主要是ＧⅠ型和ＧⅡ型。 设备和材料 3.2 组织匀浆器或其他可以破碎样品的工具。 3.3 普通冰箱，超低温冰箱（-80℃±5℃）。 3.4 高速冷冻离心机（最大离心力大于15000g）。 3.5 恒温水浴箱37℃～65℃。 3.6 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 电泳仪。 凝胶成像系统。 3.10 震荡混匀器。 pH计。 水过滤系统。 微量可调移液器：1 μL～10 μL，10 μL～100 μL，100 μL～1000 μL。 洗耳球或电动移液器。 无RNA酶的玻璃容器、微量加样器吸头、无菌50mL离心管、无菌1.5mL离心管和PCR管。 无RNA酶的一次性移液管10mL、25mL。 混合硝酸纤维素膜，孔径0.22μm。 4 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。 4.1 无RNA酶的超纯水：见附录A.1。 4.2 甘氨酸缓冲液：见附录A.2。 4.3 PEG 8000沉降液：见附录A.3。 4.4 MgCl2溶液：见附录A.4。 4.5 牛肉膏-甘氨酸洗脱液: 见附录A.5。 4.6 氯仿。 4.7 1 mol/L盐酸。 4.8 1 mol/L NaOH。 4.9 病毒RNA提取试剂盒。 4.10 Taq DNA聚合酶：-20℃保存，避免反复冻融。 4.11 逆转录酶：-20℃保存，避免反复冻融。 4.12 RNA酶抑制剂：-20℃保存，避免反复冻融。 4.13 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。 4.14 引物和探针：使用浓度为25 μmol/L，-20℃保存，引物和探针序列见表1和表2。 表1 普通RT-PCR检测引物 检测的病毒类群 引物序列 片段大小/bp GI和GII 正向引物F：5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’ 326 反向引物R: 5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’ 检测的病毒类群 引物和探针序列 片段大小/bp GI 正向引物F: 5’-CGC TGG ATG CGN TTC CAT-3’ 反向引物R: 5’-CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC-3’ 探针: 5’-FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-TAMRA-3’ 86 GII 正向引物F: 5’-ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA-3’ 反向引物R: 5’-TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA-3’ 探针: 5’-FAM-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-TAMRA-3’ 89 4.15 1×TAE：见附录A.6。 4.16 分子量标记：100 bp～1000 bp。 4.17 诺如病毒阳性对照。 4.18 诺如病毒阴性对照。 4.19 溴化乙锭（EB）溶液（10 μg/μL）：见附录A.7。 4.20 10×上样缓冲液：见附录A.8。 4.21 含0.5μg/mL溴化乙锭（或 5% GoldView）的 1.5%琼脂糖凝胶：见附录A.9 。 5 检测程序  图1 诺如病毒检测程序 6 检测步骤 6.1 样品的运输与保存 6.2 样品处理和病毒富集 6.2.1 贝类 6.2.1.1 取样：首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用无菌的剪刀和镊子取贝类消化腺组织。 6.2.1.2 无菌取5g消化腺组织，在组织匀浆器中高速匀浆3 min或切碎成2 mm3以下的小块，放入50 mL离心管中，加入35mL甘氨酸缓冲液（样品重量与缓冲液体积之比为