植物碱性焦磷酸酶alkalinepyrophosphatase活性比色法.docVIP

植物碱性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量检测试剂盒植物碱性焦磷酸酶（Alkaline Pyrophosphatase）活性比色法法定量检测试剂是一种旨在使用，碱性焦磷酸酶释放出游离磷酸根，生显色反应峰值的变化，采用比色法测定其峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术精心研制、成功实验证明的。其适用于各种植物组织，包括种子、球茎（bulb）、块茎（tuber）、根（root）、种叶（coleoptile）和叶片裂解悬液样品或纯化以及粗提的酶蛋白的碱性焦磷酸酶活性及其抑制剂的检测。 产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 焦磷酸酶（Pyrophosphatase）?inorganic pyrophosphatase），属于磷酸酶家族，包括磷酸单酯酶（phosphomonoesterase）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）等。通过释放磷酸根，参与DNA合成、RNA合成、辅酶合成、钙吸收、骨形成、氨基酸合成和脂肪酸代谢的激活等代谢活动。焦磷酸酶焦磷酸酶，受到焦磷酸酶的去磷酸化作用，释放出游离磷酸根生显色反应碱性焦磷酸酶活性产品内容 缓冲液（Reagent ） 毫升 阴性液（Reagent ） 毫升 反应液（Reagent ） 微升显色液（Reagent ） 毫升 标准液（Reagent ） 微升产品说明书 1份 保存方式 保存显色液（Reagent ）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里； 显色液（Reagent ）具有腐蚀性，避免直接用手接触； 有效保证月 用户自备 15毫升离心管：用于样品处理的容器 1.5毫升离心DOUNCE匀浆器比色皿：用于比色的容器 分光光度仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。 样品准备 ，并秤重以确定组织重量（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管 （选择步骤）加入毫升 清理液（Reagent A）清洗1次 移入到一个液氮冻存管 即刻放进液氮罐过夜 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融） 放进一个15毫升锥形离心管 加入预冷的微升 裂解液（Reagent ）涡旋震荡5秒，充分混匀 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下） 将所有组织匀浆物移入15毫升离心管 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作测定准备 准备好待测样品（例如萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清） 设定好分光光度仪（温度为3℃）：波长为660nm，并置零 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 分别加入 阴性液（Reagent ）标准液（Reagent ）到每个离心管混匀 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表 管号 阴性液（Reagent ） 标准液（Reagent ） 标准磷浓度 1 X微升 微摩尔2 X微升 微升微摩尔3 X微升 微升微摩尔4 X微升 微升微摩尔5 X微升 0 0 标准曲线测定 移取0微升上述配制的标准液到新的比色皿 在30温度下孵育0分钟 加入微升 显色液（Reagent ），混匀 在37温度下孵育分钟，避免光照 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数 重复实验步骤1至四次 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔） 样品测定 移取微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿 加入20微升待测样品（总量100微克萃取液蛋白） 在30温度下孵育0分钟 加入微升液（Reagent ），混匀 加入微升 显色液（Reagent ），混匀 在37温度下孵育分钟，避免光照 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数 根据标准曲线样品浓度（微摩尔） 样品测定 移取微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿 加入20微升待测样品（总量100微克萃取液蛋白） 在30温度下孵育2分钟 加入微升 反应液（Reagent ） 在30温度下孵育0分钟 加入微升液（Reagent ），混匀 加入微升 显色液（Reagent ），混匀 在37温度下孵育分钟，避免光照 即