hTERT-siRNA对人肝癌细胞QGY增殖活性影响.doc

hTERT-siRNA对人肝癌细胞QGY增殖活性影响【摘要】目的：利用siRNA在肝癌细胞内诱导RNAi，抑制hTERT基因表达，探讨RNAi对肝癌细胞增殖活性的影响。方法：构建靶向hTERT基因的siRNA（hTERT-siRNA），转导入肝癌细胞株QGY，采用3H-TdR掺入法检测转染质粒后细胞增殖活性。结果：成功构建hTERT-siRNA，其对肝癌细胞增殖具有明显抑制效应，抑制率达42%。结论：hTERT-siRNA能明显抑制肝癌细胞的增殖。 【关键词】RNAi；肝细胞癌；hTERT 文章编号：1009-5519（2008）23-3487-02 中图分类号：R73 文献标识码：A 原发性肝癌是严重威胁人类健康的一种疾病，我国已成为世界上肝癌发病最集中的国家，每年新发病例约占全球的45％。目前对肝癌的治疗方法主要有外科手术疗法、经皮酒精注射、动脉栓塞、化疗等，但总的效果并不太理想。基因治疗是当今研究的热点，探索与肝癌发生、发展相关的基因为治疗靶点成为关键。 已有研究发现，端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关[1]。端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)是代表端粒酶活性的非常重要的标志物，它的表达与端粒酶活性具有一致性，hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89．5％[2]。研究表明hTERT的高表达能抑制细胞凋亡，导致细胞永生化[3]。本实验依据RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理，使用短发夹样RNA设计的RNAi-DNA载体方法，以hTERT基因为靶点，构建稳定表达小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的肝癌QGY细胞株，探索hTERT siRNA对QGY细胞增殖活性的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株：人肝癌QGY细胞株购自中科院上海细胞生物研究所。常规培养于含10%新生牛血清及青、链霉素的RPMI-1640培养液，37℃、5% CO2孵箱中培养。 1.1.2 质粒：质粒pGenesil-1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司。 1.1.3 试剂：限制性内切酶BamH1、Hind III和EcoRI购自Takara公司，总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；PCR试剂购自Takara公司；siRNA-hTERT转录模板由上海生工公司合成。 1.2 pGenesil- hTERT-siRNA质粒构建：shRNA发夹结构序列长度为65 bp，两端分别为BamH1、HindIII 酶切位点，中间为9 bp茎环序列分隔的反向重复靶序列，并以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。质粒构建采用BamH1、HindIII双酶切空质粒pGenesil-1，将shRNA-hTERT转录模板5’-AAGTGTCACAGCCTGTTTCTG-3’和阴性对照转录模板5’-AAGCTTCATAAGGCGCATAGC-3’（与人基因无同源性）分别设计成发夹结构，定向克隆至该载体上，经筛选、酶切鉴定后，进行测序确定，命名为pGenesil-A，阴性对照命名为pGenesil-B。 1.3 质粒转染：采用LipofectamineTM2000脂质体转染法。转染前1天，换取无抗生素培养液，按5×103/孔接种96孔板，置37 ℃培养。待细胞增至90%~95%时，将细胞分为两组，每组12孔，按1∶4的质粒-脂质体复合物分别进行转染质粒pGenesil- A和pGenesil-B至细胞中。培养24 h后换G418选择培养液，继续培养12h后进行3H-TdR掺入法实验。 1.4 3H-TdR掺入法检测转染质粒后细胞增殖活性：每孔加入3H-TdR 1μCi，继续培养12 h，PBS清洗、胰酶消化后，收集细胞至玻璃纤维滤纸。晾干后，加入装有闪烁液的闪烁瓶中用液体闪烁计数仪检测3H放射强度(cpm值)。 1.5 统计学处理：cpm值以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS12.0软件包进行处理，两组组间差异比较采用t检验，P＜0.05被视为有统计学意义。 2 结果 2.1 重组质粒的鉴定：质粒pGenesil-A和pGenesil-B经Hind III和EcoR I双酶切，同时做pGenesil-1空载体双酶切对照。1%琼脂糖电泳，pGenesil-1空载体经双酶切后呈2条带，分别为4.54 kb的载体片段和364 bp的小片段；而重组质粒则为4.54 kb的载体片段和425 bp的目的片段。测序结果均正确。 2.2 细胞增殖活性检测：转染质粒pGenesil