LY294002对人乳腺癌细胞株MCF-7-ADR耐药逆转作用.doc

LY294002对人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR耐药逆转作用[摘要] 目的 探讨PI3K/Akt信号转导通路特异性阻滞剂LY294002在体外对人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR的耐药逆转作用。方法 乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/ADR各自分为未加LY294002的对照组及加入不同浓度的LY294002组,MTT法观察各组药物的细胞毒作用。选用流式细胞术(FCM)检查细胞凋亡率、细胞分布周期的变化。结果 ①LY294002在浓度10μmol/L以下时对两种细胞基本无毒性,为安全有效的逆转剂量。②阿霉素对MCF-7和耐药细胞MCF-7/ADR的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.14±0.02)μmol/L和(15.74±0.08)μmol/L,耐药倍数为112倍。③LY294002能够增强阿霉素对MCF-7/ADM的细胞毒作用,LY294002浓度0.1、2.5、5.0、10μmol/L分别作用于 MCF-7/ADM细胞48h后,耐药细胞株的IC50分别降至(13.53±0.10)μmol/L、(10.24±0.08)μmol/L、(5.53±0.16)μmol/L、(2.29±0.12)μmol/L,差异有统计学意义(P 2实验方法 2.1细胞培养 MCF-7和MCF-7/ADR细胞用含10%小牛血清的1640培养液,在37℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化传代。 2.2MTT比色法检测 2.2.1 MTT法测定LY94002的安全浓度 实验分MCF-7+ LY294002组、MCF-7/ADR+LY294002组、对照组,收集对数生长期细胞,调整MCF-7和MCF-7/ADR细胞浓度分别为 0.5×108cells/L和1×108cells/L,按每孔100μL铺96孔板,培养24h,待细胞贴壁后将MCF-7和MCF-7/ADR细胞按以上分组加药,LY294002浓度分别为5、10、20、40μmol/L,每组所加药物最终为100μL,每组设3个复孔,培养24h后每孔加入20μL(0.5g/L)的MTT溶液,培养4h后小心吸去孔内培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),置摇床低速震荡10min。自动酶标仪492nm测各孔吸光度(A)值,取三组平均值,计算细胞生长抑制率。抑制率(%)=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。 2.2.2MTT法测定MCF-7/ADR耐药细胞株的耐药倍数实验分MCF-7+阿霉素组、MCF-7/ADR+阿霉素组、对照组。取阿霉素浓度0.1、0.2、0.4、0.8μmol/L 具体方法同上。求出阿霉素半数抑制浓度(IC50)及MCF-7/ADR细胞的耐药倍数。耐药倍数= MCF-7/ADR细胞 IC50/MCF-7细胞IC50。 2.2.3MTT测定LY294002对MCF-7/ADR的逆转作用将两种细胞各分为对照组(MCF-7+阿霉素,MCF-7/ADR +阿霉素)、实验组(MCF-7+LY294002 +阿霉素,MCF-7/ADR +LY294002 +阿霉素)、空白组。LY294002取第一步筛选的无细胞毒性浓度范围内取值分别为0.1、2.5、5.0、10μmol/L,每个浓度设3个复孔,余法同上。逆转指数RF=对照组耐药细胞IC50/实验组耐药细胞的IC50;相对逆转率=(对照组耐药细胞IC50-实验组耐药细胞IC50)/(对照组耐药细胞IC50-对照组敏感细胞IC50)×100%,重复试验3次。 2.3FCM检测 2.3.1细胞周期和凋亡将生长状态良好的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞分别接种于6孔板中,24h贴壁后,按以上分组加入相应质量浓度的药物进行培养,空白对照组加入1640培养液,48h后用0.25%胰酶将细胞消化,1000r/min离心4min,弃去上清,PBS清洗1次后,70%酒精固定4h,离心,PBS液洗2次,每次洗后1000r/min离心4min,加入质量浓度50mg/mL的PI 200μL,避光密室放置约20min,再各加入PBS液400μL,上机检测。 2.3.2细胞内阿霉素含量的测定用75cm的细胞培养瓶培养MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞,消化并用培养基制成2×106 个/L细胞悬液,计数;对照组加入阿霉素,实验组加入不同浓度LY294002与阿霉素共同作用。37℃保温半小时,1500r/min离心2min,除去培养液,再用新培养液细胞外的阿霉素;在37℃保温10min以后,再用1640培养液洗一次,放在冰冷的新1640培养液中待检测;流式细胞仪以488nm的激发光测试细胞荧光强度。 2.4统计学分析 全部资料使用SPSS 1