及营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡影响.doc

及营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡影响摘要：目的观察和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法以皮下大量注射异丙肾上腺素(ISO)的方法制各慢性心衰大鼠模型，随机分为模型对照组，卡托普利组，参麦注射液组，和营安心大、中、小剂量组。另设正常对照组，用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，用免疫组化方法检测心肌细胞Bax，Bc12蛋白表达，计算Bcl 2／Bax比值。结果模型对照组TUNEL法心肌细胞凋亡严重，棕褐色细胞核明显增多，免疫组化图像分析Bax表达明显升高，Bcl2，Bcl2／Bax比值明显下降。与模型对照组比较，和营安心方组心肌细胞凋亡数量明显减少，Bax蛋白表达明显下降，Bcl2，Bcl2／Bax比值明显升高。结论和营安心方有减抑慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的作用。 关键词：和营安心方；心力衰竭；细胞凋亡；血流动力学 慢性心衰属于虚劳“心损”的范畴，《难经》认为“损其心者，调其营卫”，我们宗《难经》之旨，确立了“调和营卫、化淤利水”的慢性心衰治则，组成和营安心方。本实验观察了和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。 1　材料与方法 1.1材料 雄性Wistar大鼠70只，体重200～240g，购自河北省实验动物中心；和营安心方由西洋参6g，玉竹15g，云茯苓15g，桂枝15g，丹参20g等组成，中剂量组水煎浓缩为1：1煎液(每毫升含生药1g)、大剂量组为1：2煎液(每毫升含生药2g)、小剂量组为2：1煎液(每毫升含生药0.5g)，药物购自北京同仁堂药店；盐酸异丙肾上腺素注射液，2ml：1mg／支，上海禾丰制药有限公司；卡托普利，25mg／片，常州制药厂有限公司；参麦注射液，10ml／支，河北神威药业有限公司；MK1020原位细胞凋亡检测试剂盒，武汉博士德生物工程公司；Box，Bel-2一抗，二步法TV6001免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司。 1.2方法 在参考文献的基础上，略加改进并经预实验证实，采取皮下多点注射异丙肾上腺素(1SO)的方法，第1天按20mg／kg，第2天按10mg／kg，第3～12天按5mg／kg的剂量连续皮下给药，另取11只大鼠为正常对照组，皮下注射等量蒸馏水。造模结束后随机取2只正常大鼠、5只造模大鼠测定血流动力学指标，两组指标差异明显，确认模型制备成功。造模大鼠随机分为模型对照组，参麦注射液组，卡托普利组，和营安心大、中、小剂量组，每组9只。以人与大鼠体表面积等效剂量比折算量为和营安心中剂量组，扩大两倍为大剂量组，缩小两倍为小剂量组，每次灌胃0.8ml／100g，1次／d；卡托普利组配成0.45％蒸馏水溶液，每次灌服1ml／100g；正常对照组及模型对照组灌服蒸馏水1ml／100g；参麦注射液组每天按5ml／kg腹腔注射参麦注射液；连续给药4周。 1.3观测指标 1.3.1血流动力学指标测定实验结束，大鼠腹腔注射20％乌拉坦麻醉(1ml／100g)，游离右侧颈总动脉并插入自制的心室插管(充满1％肝素)，通过左侧动脉瓣和房室瓣进入左心室，用多导生理记录及分析系统描记记录左室内压峰值(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升、下降最大速率(±dpldtmax)。 1.3.2心重指数开胸提起心脏，按相同位置剪断肺静脉、肺动脉、主动脉和上下腔静脉，取出心脏，分析天平称取心脏重量，计算心重指数(心重mg／体重g)。 1.3.3TUNEL法检测心肌细胞凋亡纵向剪开左心室，从乳头肌处横切0.3cm×0.5cm的心肌标本，置于10％中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，按照试剂盒说明严格进行操作，用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，以细胞核染成棕褐色为阳性结果，每组每个心肌标本各取1张切片，每张切片计数5个高倍视野(400×)，计算各组每高倍视野阳性细胞数。 1.3.4心肌Bax，Bel-2蛋白表达及Bcl-2／Bax比值按照二步法TV6001免疫组化试剂盒的说明进行操作，每组每个心肌标本连续切片，Bax，Bd-2染色各取1张切片，棕褐色阳性颗粒主要表达于细胞浆，采用计算机图像分析系统进行半定量分析，摄取400×图像输入分析系统内，测定各组图像的平均灰度值，每张切片于阳性区选择5个无重叠视野，以灰度值大小作为待测蛋白的阳性表达指数，并计算Bd-2／Bax比值。 1.4统计分析 实验数据用±s表示，应用SPSS12.0进行统计学处理，用单因素方差分析进行组间比较。 2　结果 2.1和营安心方对血流动力学、心重指数的影响结果见表1。与正常对照组比较，模型对照组LVEDP明显升高，LVSP，±dp／dtmax明显降低，心重指数明显增加，差异有统计学意义(P0.01)；与模型对照组比较