双波长微板法快速测定ALT含量方法学评价.doc

双波长微板法快速测定ALT含量方法学评价文章编号：1009-5519（2007）19-2937-02 中图分类号：R416 文献标识码：B 丙氨酸氨基转移酶（ALT）是诊断肝脏功能的重要指标。目前各基层血站及中心血库多采用赖氏试管法测定，手工加样次数多，费工费时。随着无偿献血的大力推广，流动采血已经逐步取代血站固定点的采血。如果只做HBsAg快速金标试纸条初筛，初（复）检ALT阳性率比例较高，特别城市内采血更为突出。但无偿献血者又不愿长时间等待。另外，轻度脂血的数量也在增加，ALT假阳性明显增高。笔者利用双波长微孔板丙酮酸氧化酶比色法快速测定ALT含量，可自动判定阴（阳）性结果。经实际应用快速准确，结果理想，可以克服上述缺点，报道如下： 1 材料与方法 1.1 测定原理： （1）L-丙氨酸+α-酮戊二酸 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸 （2）丙酮酸+O2+磷酸盐 丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+CO2+H2O2 （3）H2O2氨基安替化林+2，4-二氯酚过氧化物酶醌亚胺（显色） 1.2 仪器：TECANSPECTRA-Ⅲ型酶标仪（奥地利）；精密加样器（TECAN公司），96孔微孔平底板（厦门新创公司） 1.3 试剂与方法：血清ALT测定试剂盒（上海伊华医学科技有限公司）。整个加液量均缩小为丙酮酸氧化酶比色法试管法的1/5。在微孔板上设A11、A12为空白，B11、B12为标准孔（校准血清为已知定值血清，其值为47赖氏法单位）具体操作方法见表1。 1．4 计算及判断方法：Cutoff=[25×(B11+B12)/2]/47，样品OD值/Cutoff≥1为阳性（ALT≥25赖氏法单位），样品OD值/Cutoff＜1为阴性（ALT＜25赖氏法单位)。 2 方法学评价 2．1 线性范围试验：使用不同的已知ALT定值血清，用上述方法测定各自的吸光度，以定值血清的ALT值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标作反应曲线图，见图1。本方法在低值ALT的测定中的线性还是良好的。由于我们是定性检测而非定量检测，故只要求在25单位左右有良好的线性就行。 2.2 重复性试验：（1）批内重复性试验本方法是测定该试验方法的偶然误差。用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一试验室由同一人操作，对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于评价该试验方法的随机误差的大小。选择ALT含量约为25赖氏法单位的血清标本用丙酮酸氧化酶比色法作5轮，每轮4次测定，可获得20个测定数据。见表2。（2）批间重复性试验：同时以一份标本作批间测定20天，结果依次为：25.11、25.33、25.75、24.98、26.13、24.56、26.11、25.17、24.72、24.92、 25.34、25.34、25.19、25.02、25.31、26.01、24.73、24.83、25.66、25.16。批间均数=25.22、批间标准差=0.504，变异系数（CV%）=1.99%。提示本试验方法批内、批间变异系数较小，精密度良好，符合临床检测的要求。 2.3 该方法与全自动生化分析仪的比较：对2006年4季度755名无偿献血者血样分别用丙酮酸氧化酶比色法和医院检验科的全自动生化分析仪进行检测。以全自动生化分析仪的检测结果作为ALT检测的金标准，以大于25赖氏法单位为阳性，小于25赖氏法单位为阴性对比，见表3。 由此可知丙酮酸氧化酶比色法已经达到血站对ALT检测的要求，且此方法检测为阴性的标本用全自动生化分析仪检测结果为阳性的很少。故该方法用于无偿献血者的初筛检验中，可以避免因未做ALT初筛而带来的血液的报废。 目前血站采血采取的两种模式：（1）初筛―初检、复检，初筛后及时采血（献血），再做初复检，ALT未列入初筛检测项目。（2）初检―复检，先初检后采血（献血），因为血站初检较大一批献血者后，一般在1周内组织采血，而引起ALT升高的原因很多，除肝胆、心血管疾病和骨骼疾病外，诸多非病理因素如药物、酒精和疲劳、运动等也能引起ALT的轻度升高。国外统计由于ALT升高而被报废的血液约占2%～3%，其中70%与输血传染病无关，这对供血不稳定地区是严重的损失。因此在初筛时同时快速检测ALT含量，检测合格立即采血。这样既减少了献血者的不合格率，又便于血站及献血单位组织工作，减少合格血源流失。 该方法运用自动判读技术，一方面避免了由于人为判读的视觉误差而造成的结果错误，增加了阳性血的检出率，另一方面实现了血站实验室化验结果档案的完全计算机管理，建立了比较完善的实验室记录，符合目前形势的要求。双波长微孔板快速法测定ALT省工省时，省试剂，且可