反相高效液相色谱法测定虫草制剂中核苷类化合物含量.doc

反相高效液相色谱法测定虫草制剂中核苷类化合物含量【摘 要】目的建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定虫草制剂中腺苷和尿苷含量的方法。方法采用水浴温浸和加热回流的方法,制备供试品溶液。色谱柱为Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm)流动相为pH 6.5磷酸盐缓冲液∶甲醇(85∶15),检测波长为260 nm。结果方法的平均加样回收率:腺苷为98.9%,RSD为1.4%(n=6);尿苷为97.9%,RSD为1.5%(n=5),腺苷在23.2～928.0 mg/L范围内线性关系良好,尿苷在16.0～640.0 mg/L范围内线性关系良好。结论此方法简便、准确,重现性好,可作为判定虫草制剂质量的一种方法。 【关键词】冬虫夏草;金水宝胶囊;至灵胶囊;宁心宝胶囊;反相高效液相色谱法;核苷类化合物 冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是滋补强壮的名贵中药,具有补虚损,益精气,补肺益肾,止咳,化痰,止血,滋阴壮阳,阴阳并补等功效,临床上广泛应用于急、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿等,疗效卓著,其所含的核苷类成分为其有效成分之一,其中腺苷具有改善心脑血液循环[1]、防止心律失常[2]、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性[3]等作用,已被用作冬虫夏草的质控指标[4]。但由于天然冬虫夏草对生长环境有特殊的要求,故自然资源极其匮乏。近年来研究人员从天然冬虫夏草中分离出来的虫草真菌,经培养、发酵得到人工培养菌丝体[5-6],为药源紧缺的天然冬虫夏草开辟出新的有效的药源,已开发出金水宝胶囊、至灵胶囊和宁心宝胶囊等多种虫草制剂。本实验拟采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对其中核苷类成分同时测定分析,以达到质量综合评价的目的。实验结果表明,两种核苷类成分在同一色谱条件下均得到较好分离,并可进行含量测定。该方法样品预处理简便,回收率高,易于操作。 1仪器和药品 1.1仪器高效液相色谱仪(美国Waters公司);Waters 510输液泵(美国Waters公司);U6K进样阀;Waters 484型紫外检测器;Base 810色谱工作站(美国Waters公司);Hamilton微量进样器(瑞士Bonaduz公司)。 1.2药品金水宝胶囊(江西金水宝制药有限公司,批;至灵胶囊(大同市利群药业有限责任公司,批;宁心宝胶囊(正大青春宝药业有限公司,批号0511003);腺苷(美国SIGMA公司);水为重蒸水;尿苷(中国药品生物制品检定所,批号887-200001);甲醇、乙醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。 2方法和结果 2.1色谱条件色谱柱:Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm);流动相:pH 6.5磷酸盐缓冲液∶甲醇(85∶15);流速:0.9 mL/min;检测波长:260 nm;柱温:室温;灵敏度:0.02 AUFS;进样量:10 μL。 2.2对照品溶液的制备分别精密称取60℃干燥至恒重的对照品腺苷5.80 mg和尿苷4.00 mg置同一量瓶中,加50%乙醇溶解定容至5 mL作为对照品溶液。 2.3标准曲线的绘制分别取对照品溶液各1.0 mL,混合均匀,0.45 μm 的微孔滤膜滤过,置于5 mL容量瓶中,50%乙醇定容,精密吸取0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL的标准品溶液。在上述色谱条件下,分别进行测定。结果(图1 A),以浓度为横坐标(C,mg/L),峰面积(A)为纵坐标,绘出标准曲线,得回归方程。回归方程腺苷A=18.012C-0.023 5;线性范围23.2～928.0 mg/L (r =0.999 8);尿苷A=36.329C-0.002 7;线性范围16.0～640.0 mg/L(r =0.999 6)。 2.4供试液的制备取金水宝胶囊、宁心宝胶囊和至灵胶囊中药物粉末,分别编号并精密称取500 mg,加入20%乙醇50 mL,温浸14 h后,超声处理30 min,滤过,滤液减压浓缩至干,残留物用50%乙醇溶解,转移至5 mL量瓶中,临用前经0.45 μm微孔滤膜过滤,定容至刻度。 2.5精密度试验取同一浓度的对照品溶液,重复进样5次,进样量10 μL,测得腺苷和尿苷标准品保留时间及峰面积的RSD分别为1.43%、1.36%;1.27%、1.50%。 2.6重现性试验按照拟订的方法处理5份样品,在拟订的色谱条件下进行测定,测得腺苷和尿苷的RSD分别为1.41%、1.86%。 2.7样品测定取金水宝胶囊、至灵胶囊和宁心宝胶囊,3种样品按2.4项下制备供试液,在2.1项下每个样品重复测定3次,测定结果(表1),色谱图(图1)。