影响微生物限度检查及方法验证因素研究.doc

影响微生物限度检查及方法验证因素研究文章编号：1009-5519（2007）15-2329-02 中图分类号：R446 文献标识码：B 微生物限度检查法及其方法验证的主要特点在于检验对象本身的特殊性。其特殊性为：（1）能繁殖的活细胞生物。该活细胞处于不稳定状态，可随存放时间延长而亡，也可在适宜条件下大量繁殖。而检测条件的状况不一可使其生长情况各异，因而常出现同批样品在不同条件下检测，有不同的结果。但在保存条件相对稳定时，微生物在一定时间内处于动态平衡，在标准化的条件下操作结果仍可予与正确评估。（2）不确定性。药品受微生物的污染，其种类可以多样，污染情况依生产、设备、原料、管理、剂型等条件而定，非药品本身固有。被污染批次中的不合格品是一个随机变量。（3）分布的不均匀性。这种不均匀性源于污染源的复杂性，如原辅料污染，工艺污染，空间污染和操作人员污染。再者，微生物具有簇团性，簇团大小，紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。 除了上述检验对象本身的特殊性外，微生物限度检查法及其方法验证程序繁琐，检验周期长，干扰因素多，容易造成检验结果误差，现将主要原因分析如下。 1 标准菌株的选择和保存不当引起的实验误差 实验中的对照菌株必须为标准菌株，其生物学特性应典型稳定，其细胞群应具有相似性和合适的培养，储存条件。如形态变异、菌落变异、耐药性变异或受损等均可使平板中细菌呈丛集、分散不均或死亡。2005版药典[1]要求所用标准菌株的传代次数不得超过五代。 实验中所用对照菌均为无芽孢杆菌，以菌液状态存活的时间都不长。有研究表明[2]，分别用0.9%无菌氯化钠溶液和氯化钠-蛋白胨缓冲液制备的不同浓度菌液，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在3天内活菌数下降约40%，5天内下降约70%，用0.9%无菌氯化钠溶液和氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液结果无明显差异（冰箱4℃保藏）。建议采用新鲜培养物。 2 不同供试液制备方法造成的实验误差 应按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供液，制备供试液时，力求均匀分散。测定结果与匀质方式及条件极为有关。如有菌，分散充分时菌落生长数多，反之则少。通常药品都有一定的pH值，分散度不同导致供试液不同的pH值而影响微生物的生长，可得到不同的实验结果。应按药典首选匀浆仪法，并注意转速和时间，确保制备均匀的供试液。转速4000 r/min，时间2分钟。试验证明[3]，对8批水丸分别用匀浆仪和振荡器处理后，测定细菌数，其结果后者比前者少一半，经统计学t检验分析，差异有显著性（P0.05）。大量实验表明[4]，供试液作递增稀释时，分别吸取混悬液与上清液测定细菌数，霉菌数时，计数结果相差显著，上清液明显低于混悬液。复方丹参片，六味地黄丸和刺五加片在部分细匀时细菌数分别为7.2×103个/克，2.4×104个/克和2.1×102个/克，而当完全细匀时细菌数分别为1.4×104个/克，3.4×104个/克和1.2×103个/克，差异均有显著性。如果药品有抑菌作用，则在检查及方法验证时影响更为突出。分散不均匀，试验开始时取样既造成误差，含药量高使活菌检出量减少，阳性对照菌回收率降低。这时检验结果的准确性主要取决于供试品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖，有抑菌作用的检验结果是不准确的，应排出其抑菌活性。 3 培养基的影响 培养基是培养检测微生物的营养物，其质量的好坏，稳定与否直接影响检验结果。通过对电炉直火加热融化培养基及用剩余培养基包扎冷藏后融化再使用的阳性对照实验[5]，发现这两种操作对实验结果造成的误差达21%和18%。多次反复加热培养基，可使其中糖、微生物和氨基酸受破坏，影响质量。而pH值的改变影响更为严重，因各种微生物皆有其适宜生长繁殖的pH值。霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH为中性或微碱性的注皿时温度应控制在45℃，过高细菌易受损或致死。注皿量约15 ml，厚度约4 mm，薄水分易散失，不利于微生物生长，过厚需氧菌不利于生长。 一些选择性培养基加入胆盐作为抑菌剂，抑制革兰阳性菌，使革兰阴性菌能良好生长，但有试验发现[6]，胆盐用量过大对大肠埃希菌也有抑制作用，且当加菌量较大时，革兰阳性菌也能生长。针对金黄葡萄球菌能耐高盐而其他菌无此特性，对卵黄高盐培养基中不同浓度的氯化钠作了测试[7]。结果，试验浓度均不能抑制大肠杆菌、枯草杆菌生长，其菌落数未见明显差异。而一些对大肠杆菌抑制作用较强的药品[8]，可将增菌液由胆盐乳糖改为硫乙醇酸盐，结果阳性检出率为88%，大大高于胆盐乳糖25%的检出率。应注意大肠埃希菌MUG培养基其pH值灭菌后不得过7.4，否则pH值偏高，MUG自行分解，产生