荧光定量聚合酶链反应在病毒性肝炎诊疗中应用.docVIP

荧光定量聚合酶链反应在病毒性肝炎诊疗中应用摘要：荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)是目前应用较为广泛的核酸定量方法，病毒核酸定量能直观地反映病毒在体内的复制程度，因此，FQ-PCR在对病毒性肝炎的早期诊断、治疗、疗效观察及判断预后等方面有着显著的应用价值。 关键词：病毒性肝炎；荧光定量聚合酶链反应；诊断 中图分类号： R512．6；R446 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2007)06-1412-02 聚合酶链反应（PCR）技术是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，自1985年问世以来，已成为生物医学领域最有价值的研究手段之一[1]。PCR技术经历了由定性走向定量的发展过程，荧光定量PCR（FQ-PCR）就是近年来发展起来的备受关注的定量PCR技术，主要用于核酸定量检测，可反映病毒在体内的复制情况。该技术在临床上感染性疾病应用中相当广泛，尤其是在病毒性感染疾病的诊疗方面的应用更为普遍。病毒性肝炎的病原体主要有甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、庚型肝炎病毒（HGV）及输血传播病毒（TTV）等。甲型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎有较好的血清学诊断指标，一般不需要进行基因诊断，庚型肝炎病毒（HGV）及输血传播病毒（TTV）分别自1996年、1998年以来国内才有所报道[2]，其基因诊断在临床上应用较少。FQ-PCR主要用于对乙型肝炎和丙型肝炎的早期诊断、治疗、疗效监测以及预后判断、分子流行病学调查等方面，以下就其各临床应用作一综述。 1 分析技术 PCR技术其实是脱氧核糖核酸（DNA）热变性、复性原理的应用，循环重复着 “变性―退火―延伸”三个基本反应步骤。FQ-PCR是指在普通PCR扩增体系中，加入一个靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，5′端标记荧光发射集团，3′端标记荧光淬灭集团，当探针完整时，后者抑制前者而不发光；当有靶基因存在时，在PCR复性阶段，探针与靶基因互补，在PCR延伸中，由于Taq酶（一种耐热DNA聚合酶）具有5′-3′的外切酶活性，引物沿模板延伸至标记探针结合处，将5′端荧光发射集团切下，经激光照射产生荧光，在这时检测系统收集PCR扩增系统中荧光，其强度与PCR产物量成正比关系[3-5]。该技术以外标准作为定量依据，将即时检测荧光强度与标准曲线相比定量，最终反映原始模板定量[3]。该技术把基因扩增PCR、分子杂交和光化学融合为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术在整个扩增过程中保持在封闭状态下，不需PCR后处理，即不需将扩增后的PCR产物取出再进行结果分析，且在系统中又使用了尿苷酶（UNG酶）预防污染，极大降低了假阳性结果的发生率[6]。 ２ FQ-PCR在病毒性肝炎诊疗中的临床应用 2.1 早期诊断 2.1.1 诊断乙型肝炎 临床上常用血清免疫学方法检测患者血清中乙型肝炎病毒的抗原或抗体，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是乙型肝炎病毒抗原的一种，一般通过测定患者血清中HBsAg即可明确诊断，不需要进行HBV核酸检测来诊断。但在某些情况下，患者血清中HBsAg用免疫学方法检测不到：①HBsAg抗原量过低，未达到检出水平；②出现乙型肝炎表面抗体（抗HBs），存在HBsAg与抗HBs复合物，抗体优势时HBsAg被掩蔽；③基因变异不产生HBsAg；④血清中单独HBV核心抗体（抗HBc）阳性等等。在以上各种情形下，血清中HBV DNA可能为阳性。HBV DNA是反映病毒是否复制的直接指标，HBsAg阴性而HBV DNA阳性表明患者存在现症感染。因此，FQ-PCR检测HBV DNA可用于血清中乙型肝炎病毒的抗原或抗体滴度低时诊断肝炎。 2.1.2 诊断丙型肝炎 目前临床上对丙型肝炎的诊断主要依靠血清标记物抗HCV的IgG抗体的检测，但此抗体只是间接反映了患者有HCV感染，其在体内不易被清除，持续时间较长，可维持在10年左右[7]，因此该指标不能区别是现症感染还是既往感染，即不能准确地反映病情。HCV在血液中复制水平低，血清中的病毒较少，抗体的产生较晚，一般在感染的第2周以后才产生抗体，通常存在有“窗口期”问题，而有部分患者因免疫力低下或使用了免疫抑制剂（如白血病患者），体内可能不产生抗体而造成漏检。血清HCV RNA是HCV感染的直接依据，是反映HCV复制的可靠指标，检测HCV RNA是目前唯一能直接检测病毒血症的方法[2]。杨东亮[8]研究表明，血清中的HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志，检测血清HCV RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”，其