免疫共沉淀原理和实验方法.docVIP

HYPERLINK /member/signup/reg_step1.php \t _blank 注册┆ HYPERLINK /login/login_top.php \o \t systemIframe 登录┆ HYPERLINK /control/writing/scriber/article_add.php?mode=1 \t _blank 发表文章 ? HYPERLINK javascript:void(0) 免疫共沉淀原理及实验方法 HYPERLINK javascript:void(0) ? HYPERLINK javascript:void(0) ? 2007-03-22 16:07:46 HYPERLINK javascript:%20void(0); 大 HYPERLINK javascript:%20void(0); 中 HYPERLINK javascript:%20void(0); 小 免疫共沉淀一 原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续)二 准备：器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinA sapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIPA缓冲液 (最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%TritonX-100 25ml (1%)10% DOC 50ml (1%)10%SDS 5ml ( o.1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 395mltoal 500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)2.NP40 lysis 缓冲液1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%NP40 25ml (1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 450mltoal 500ml使用前加1mM的PMSF注意点：*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。*反复使用PMSF要注意保管方法。*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOCSDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。Protocol1 调制protein A sapharoseprotein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉