牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达.PDF

维普资讯 一 27一 中国动物检疫 2o06年第 23卷第 7期 目主持人：胡藕祥 文章编号：1005—944X(2006)07-0027—03 牛传染性鼻气管炎病毒 gD基因的克隆与表达 曲光刚 ’· 单 虎 ’ 张 志 李晓成 郭丽霞 3》 f1．山东莱阳农学院 动物科技学院 青岛 265219 2．中国动物卫生与流行病学中心 青岛 266032 3．扬州大学兽 医学院 扬州 225009) 摘要：构建pET32a重组表达载体，转化到BL21(DE3)，诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组 gD蛋白。用已 发表的 IBRV的gD基 因序列设计一对特异性 引物，通过PCR方法扩增一条 766bp的 目的基 因gD，将 gD基 因克隆到原核表达载体pet32a，得到重组表达载体 pet32一gD，转化到BL21(DE)中，通过 IPTG诱导获得融合蛋 白。重组表达蛋 白经纯化后，免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋 白具有 良好的免疫原性。 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒：牛；gD蛋白；原核表达 牛传染性鼻气管炎fIBR1是 由 1．1 质粒和菌株 GAC G．I’I’GCC AAA G 3’ 牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)~名 表达载体 pET32a 由本实验室 上下游 引物扩增 gD基 因 目的 牛疱疹病毒 I型、坏死性鼻炎病毒、 保存 ，DH5ot、大肠杆菌 BL21(DE3) 片段 ，预期扩增产物长度为 766bp． 传染性脓疱外阴一阴道炎病毒引起 菌株购于大连宝生物公司： 克隆至 pET32a载体 ，理论上表达 牛的一种急性 、热性 、接触性传染 1．2 酶和相关试剂 一 分子量约 53kD、N端带有 His— 病 ，以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎 TaqDNA 聚合酶 、T4DNA连接 tag的融合蛋 白。 和上呼吸道炎症为主要特征 ．还引 酶 、dNTP、限制性 内切酶 Hind11I、 1．6 目的基 因的克隆 起母牛流产和死胎 、肠炎及小牛脑 BamH I购 自Takara公 司 ：DNA 以提取的核酸为模板 ．利用设 炎 ，有时发生结膜炎和角膜炎。本病 快速纯化回收试剂盒购 自上海生物 计好 的引物 PCR 扩增含有 Hind 的病原体是牛传染性鼻气管炎病 工程 公司 ：IBRV 阳性血清 由本实 11I、BamHI酶切位点的gD基 因。 毒 。又称牛疱疹病毒 l型，属于疱疹 验室保存 PCR 反应条件 ：94cI=5min：94oCl 病毒 ，0疱【疹病毒亚科水痘病毒属。 1．3 病毒扩增 min，55~Clmin，72~C50s，5个 病毒粒子呈圆形 ．由 162个壳粒组 IBRV (bathNu／57株 购 自中 循环 ：49oClmin．65oC lmin， 成正 20面体 ，直径约 130—180nm， 国兽药监察所)接种到 MDBK细 72cI=50s．共 30个循环 ：72cI=l0 由核芯、衣壳和囊膜三种微细结构 胞 ，培养 36—72h后 ，待 70％左右 的 min l％琼脂糖凝胶电泳检查 PCR 组成。 细胞出现细胞病变 (CPE)时．收获 产物 。用 限制性 内切酶 Hind11I、 50年代在美国首次发现本病 ． 细胞及上清液 ，反复冻融 3次 ，离心 BamH1分别对 目的基因PCR 产物 目前在世界范围内流行 ．是造成养 后去沉淀 ，将上清液用于核酸提取。 和表达载体质粒 pErI32a37cI=水浴 牛业经济损失 的主要原 因之一 1．4 病毒DNA的提取 双酶切 ，用 DNA纯化 回收试剂盒 ， EUSA等检测手段为