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生长抑制素和鲑鱼降钙素中氨基酸组成分析 喻宏伟① 廖海明② 何吕兴③ 杨定忠③ 卢娟娟① 车晓利① 齐振兴① （1 北京普析通用仪器有限责任公司 2 中国药品生物制品检定所(PITC)为衍生剂，并在衍生过程中加入二巯基二丙酸(MPA)保护半胱氨酸。同时采用反向高效液相色谱法，以正亮氨酸为内标物，使用普析通用L6-2型高效液相色谱仪及Venusil-AA氨基酸分析方法包，分析多肽样品生长抑制素和鲑鱼降钙素中氨基酸组成。测得各氨基酸含量与理论值偏差在-15%至10%之间。本方法快速、灵敏、准确，特别适用于同时含有胱氨酸和半胱氨酸的多肽氨基酸组成的测定。 氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。 氨基酸分析技术始于20世纪三、四十年代，1958年，Moore和Stein首先将离子交换树脂用于氨基酸分析中．研制出了世界上第一台用离子交换树脂和柱后茚三酮衍生检测法的自动氨基酸分析仪[1]。经过40多年的发展，氨基酸分析方法得到不断的改进和完善，逐渐发展为多种分析方法并存的局面。这些方法可以归纳为两类：一、衍生化间接分析法，包括衍牛化离子交换色谱法、衍生化高效液相色谱法、衍生化气相色谱法和衔生化毛细管电泳法；二、无需衍生化的直接分析法，主要指高效阴离子交换色谱一积分脉冲安培法(HPAEC—IPAD)[2]。 柱前衍生化高效液相色谱法分析氮基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点，已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用[2]。柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂／弱酸盐缓冲液为流动相。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)[3]、萘-2,3-二甲醛(NDA) [4]、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC) [5]、异硫氰酸苯酯(PITC) [6]、丹酰氯(Dansyl-C1) [7]、4,4’-二甲胺基偶氮苯-4’-磺酰氯(DABS—C1) [8]、6-氨基奎啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC) [9]和2,4一二硝基氟苯(DNFB) [10]等。 其中PITC衍生试剂可同时测定伯氦酸和仲氦酸，衍生副产物对测定无干扰，衍牛物非常稳定(在干燥条件下可在冰箱中长期储存)；缺点是流动相中的杂质和含硫氨基酸(半胱氨酸和高半胱氨酸)形成的二硫化合物会干扰亮氮酸的测定，不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸[11]。本实验采用二巯基二丙酸（MPA）为保护剂，保护分析中容易发生转化的半胱氨酸，使得PITC法也能同时测试胱氨酸与半胱氨酸的含量，拓展了PITC法测定氨基酸的适用范围。 材料与方法 生长抑素和鲑鱼降钙素中国药品生物制品检定所μm,4.6×250mm），购自北京艾杰尔科技有限公司。 样品水解和衍生 1. 供试品溶液的 称取生长抑素作为生长抑素供试品溶液作为供试品溶液。 2. 氨基酸标准溶液门冬氨酸sp）、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸μmol/mL，胱氨酸μmol/mL。10mg，加0.1mol/L 盐酸溶液 10ml 使溶解，混匀。 4. 水解和衍生 取供试品溶液和氨基酸对照品溶液各50μL，置石英管中，加正亮氨酸内标溶液20μL，真空干燥；加二硫代二丙酸溶液40μL，混匀，真空干燥；以6 mol/L盐酸溶液（含0.1％苯酚）为水解液，110℃ 水解24 小时，真空干燥。 加水200μL，加三乙胺溶液100μL，混匀，加异硫氰酸苯酯（PITC）溶液100μL，混匀，室温放置1小时,加入400μL 正己烷，振荡，放置10分钟,取下层溶液，滤过。 1. 流动相A：称取15.2g 醋酸钠，加水1700ml 溶解，用醋酸调pH 至6.5，然后加水 至1850ml，加乙腈140ml，滤过。 流动相B：乙腈/水＝4/1 2.色谱条件： 采用如下梯度条件 时间流速 A% B% 1ml/min 100 0 5 1ml/min 99 1 12 1ml/min 96 4 15 1ml/min 80 20 24.5 1ml/min 80 20 27 1ml/min 0 100 33 1ml/min 0 100 33.1 1ml/min 100 0 检测波长： 254nm； 柱温：℃； 进样体积： μL 结果 标准氨基酸样品分析结果 氨基酸标准溶液色谱图如图1所示。 图1 氨基酸标准谱图 （其中各峰所代表的氨基酸分别为：Pn1=Asp，Pn2=Glu，