基因产物的结构功能分析.pptVIP

分子生物学实验原理与技术 徐卫华 中山大学 昆虫所 主要内容 第一章 绪论 一、基因克隆 二、基因结构及功能 三、基因产物的结构、功能分析 生化与分子生物学实验注意事项 第二章 基本操作及常规方法 一、常规仪器与器具 二、试剂及溶液 三、常规方法 实验一、DNA 和RNA抽提 一、质粒DNA小量抽提 二、质粒DNA大量抽提 三、总RNA抽提 四、mRNA纯化 五、基因组DNA抽提 六、λ噬菌体培养及其DNA抽提 实验二、cDNA文库的构建 实验三、基因文库的构建 实验四、基因组DNA文库的筛选 实验五、Southern 和Northern杂交 实验六、亚克隆(subcloning)的二大类型 实验七、DNA 序列测定 实验八、引物延伸分析 实验九、启动子活性分析 实验十、细胞核蛋白和胞质蛋白抽提 实验十一、凝胶阻滞分析 实验十二、 DNA足迹分析 实验十三、 PCR及引物设计 第一章 绪论 70年代初，基因（遗传）工程诞生, 经过30多年的飞速发展，许多分子生物学技术被开发。 分子生物学飞速进展的原因 1 限制性内切酶和DNA相关酶的发现和应用 2 载体(vector)的开发 3 DNA测序技术的确立 限制性内切酶 识别特定的核苷酸序列 4~6个碱基对 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具， （1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）具有合适的筛选标记 （4）细胞内拷贝数要多 （5）载体的分子量要小 （6）细胞内稳定性高 目前最常用的载体包括细菌质粒、?噬菌体、cosmid质粒等。 重组DNA操作步骤： （1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接， 形成重组DNA分子 （3）转化受体细胞 （4）筛选和鉴定 （5）对细胞或生物体 通过培养，获得外 源基因表达的的产 物 分子生物学技术涉及许多方面，对一般研究人员来讲，总体上把握这么多的技术上比较困难的。近年来，简单化、省力化等的新技术的开发，从事分子生物学研究成为可能，大致可以归纳为如下几方面： 1. 基因克隆; 2. 基因的结构及其功能分析; 3. 基因产物的结构与功能分析。 一、基因克隆 1. cDNA克隆 以mRNA 为模板(template), 在试管内由反转录酶合成的互补DNA (complementary DNA, cDNA)的总称。 第一个被克隆的哺乳动物基因是家兔(rabbit)血红蛋白(hemoglobin)?链的 cDNA。 因为在红血球中, 血红蛋白mRNA占细胞总 mRNA的60%, 量多易克隆。 第二个克隆的基因是家蚕丝心蛋白(fibroin) mRNA。 多数情况下, 细胞内的基因表达量是不高的。 用克隆cDNA 的方法来克隆基因是不太容易的事， 为什么要做呢？ 理由：许多高等生物的基因中含有内含子 (intron)； 优点： cDNA构造简单,长度短, 插入载体容易； 结论：cDNA 克隆是最初要做的工作。 克隆cDNA的常规方法 目的基因的产物, 即蛋白质先要分离纯化； 蛋白测序； 基于??序列反推核苷酸； 合成寡核苷酸探针, 同位素标记； 杂交筛选cDNA文库, 最后得到目的cDNA。 经典实用 限 制：分离纯化难度大。 cDNA克隆新方法 1. 将cDNA文库在大肠杆菌中表达, 利用抗体与之结合; 2. 转录调节因子的场合, 蛋白和特定的核苷酸序列结合作为筛选指标； 3. 设计特异或兼并引物(degenerate primer), PCR (polymerase chain reaction) 或电子克隆； 4. 变异细胞作为宿主, 由于基因互补, 分离目的基因。 功能鉴定：把该cDNA转入适当的载体, 体外合成该mRNA, 再注射进爪蟾卵中；或者利用动物细胞作为宿主, 表达cDNA产物，分析翻译出来的蛋白质的功能。 2. 染色体基因（gene）克隆 染色体基因的克隆, 最初在cDNA克隆完成之后进行, 一般以克隆的cDNA为探针, 从基因组文库(genomic library)中杂交筛选分离目的基因。 基因组文库一般将10-20 kb长的DNA片段插入噬菌体